[点击浏览该文件:儿茶酚胺类神经递质介导的活性氧损伤作用的初步研究.rar]神经系统的活动和行为对于免疫功能的冲击已经引
起临床医学家的关注[1]。现已知严重的精神压力可以导
致机体的抑郁甚至更严重的疾病。临床医生已经注意到
情绪压力与自身免疫疾病之间的关系。但迄今为止对于
其内在机制的了解尚少。
材料与方法
儿茶酚胺类神经递质肾上腺素等可以通过自氧化产
生活性氧[2]。但其自氧化产生的活性氧是否能产生有病
理意义的损伤？以及这一损伤是否会影响免疫功能？为
此我们进行初步探索。
材料乙肝病毒表面抗原酶联免疫测定试剂盒(华
美生物工程公司)。硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，
TBA)(德国Merck公司)。超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Cat)(SIGMA公司)。绵羊
（小尾寒羊）16只，北京大学第一医院动物室。每只羊颈
静脉取2次血，每次取血10 mL供测定用。
方法
1.红细胞脂质过氧化测定[3]：取绵羊颈静脉血。以
DTA抗凝(2mg·mL-1全血)。1 000 r·min-1离心5 min，
下层红细胞用生理盐水洗3次，置于等量Ringer液中。
入儿茶酚胺（分别加入去甲肾上腺素和肾上腺素），于
7℃保温16 h后再用生理盐水离心洗涤红细胞(1000r·
in-1 5 min)2次。用10～20倍蒸馏水溶血。于0～2℃
件下9 000 r·min-1离心20 min，沉淀用10 mmol·L-1
ris-HCl缓冲液（pH 7.4）洗２次后置于少量生理盐水
分散。用TBA方法测定脂质过氧化，红细胞脂质过氧
程度用TBA反应的产物丙二醛（malonic dialdehyde,
DA）相对量表示，具体方法参见文献[3]。蛋白定量用
olin-酚方法。每次测定均以不加儿茶酚胺的样品作为
照。为了便于比较，本文以相对含量表达。即以未
儿茶酚胺处理的对照组质脂过氧化产物定为100，经过
茶酚胺处理的样本的脂质过氧化产物为此基础上的相
量。测定儿茶酚胺对抗体的作用（参见原酶联免疫测
试剂盒说明书）。
2.对照组检测：操作步骤如下：在乙肝病毒表面
体（单克隆抗体）与固相载体联结的板上分别加乙肝
毒表面抗原阳性和阴性血清。37℃孵育（在37℃水浴
，将反应物保温）。孵育结束后，洗涤除去其他未结合
质（乙肝病毒表面抗原阳性血清、阴性血清中只有乙
病毒表面抗原能与酶联抗体结合，因此其他所有的成
都是未结合物质，包括杂蛋白等均被洗去）。再加第
抗体（酶标抗体），孵育反应，使固相免疫复合物上的
原与酶标抗体结合。孵育结束后，彻底洗涤未结合的
标抗体。加底物（过氧化氢和邻苯二胺）显色。固相上
酶催化底物成为有色产物。在492nm比色，测定吸光
。计算标本（即阳性血清）与阴性对照吸光度的比值
patient/negtive ratio，即P/N比值）。
3.儿茶酚胺作用组检测：操作步骤如下：将与固相
体联结的乙肝病毒表面抗体与儿茶酚胺共同孵育16h，
别加入含有乙肝病毒表面抗原的阳性血清，以及不含
肝病毒表面抗原的阴性血清（以上2种血清与对照组
全相同）。按对照组的操作方法，再加入第二抗体等，
后测定反应产物在492 nm的吸光度值。计算标本
即阳性血清）与阴性对照吸光度的比值。以儿茶酚胺对
体作用的P/N比值与对照组的P/N比值比较，判断儿
酚胺对抗体的激活作用。
结的乙肝病毒表面抗体与儿茶酚胺共同孵育16 h时加入
SOD和Cat。为了排除SOD和过Cat的非酶促作用，用
高温灭活的酶作为对照。其余操作与“儿茶酚胺作用组”
相同。SOD和Cat的浓度分别为32 U·mL-1。
统计学方法采用SPSS 10.0 for Windows软件分析，
多组比较用方差分析。两组比较用t检验。
结果
儿茶酚胺对完整羊红细胞脂质过氧化程度的影响
由表1可见，肾上腺素可以显著地增加红细胞脂质过氧
化的水平(P<0.05)，而去甲肾上腺素的作用不明显。
组别
Group
对照组
Control
肾上腺素(1.5 mmo·lL-1)
Epinephrine
去甲肾上腺素(1.5 mmol·L-1)
Noradrenalin
表１儿茶酚胺对红细胞膜脂质过氧化程度的影响
Tab 1 Catecholamine induced peroxidation of membrane of RBC
注：以对照组1 mg膜蛋白的膜，脂质过氧化产生的MDA为100％。
表1表示的是与对照比脂质过氧化产物MDA的相对含量。*与对照比
差异显著（P<0.05）
Note:The membrance of 1mg protein of control produces 100 unit MDA.
Other quantity is e
XPressed by the relative quantity compared with control.
*means it is statistically significant(P＜0.05)
n
16
16
16
P值
P value
<0.05*
>0.05
MDA的相对量(±s)
Relative quantity of MDA
100±3
119±4
104±4
儿茶酚胺对抗体反应活性的影响由表２所示，0.5
mmol·L-1肾上腺素和去甲肾上腺素可以显著地增加酶
联反应的产物（P<0.05）。表现为492 nm的吸光度增
加4倍速以上。
表2儿茶酚胺对乙肝病毒表面抗体活性的影响
Tab2 CatecholamineincreasestheactivityofHBsAb
注：反应产物在492 nm进行监测。结果以样品在492 nm的吸光度与
阴性血清的吸光度的比值表示（P/N比值），并以阴性血清的值为1。
*表示与阳性血清相比差异显著（P<0.05）
Note:TheresultsareexpressedbyP/Nrationoftheopticalabsorbanceat492nm.
TheP/Nrationofnegativeserumis1.*Meansitisstatisticallysignificant(P<0.05)
P值
Pvalue
<0.05*
<0.05*
P/N比值(±s)
P/Nratio
1/
17±10
71±15
68±14
组别
Group
阴性血清
Negativeserum
阳性血清
Positiveserum
阳性血清+肾上腺素(0.5mmol·L-1)
Positiveserum+epinephrine
阳性血清+去甲肾上腺素(0.5mmo·lL-1)
Positiveserum+noradrenalin
n
16
16
16
16
4.自由基清除剂对儿茶酚胺作用的抑制作用研究：
作步骤如下：在儿茶酚胺作用组中，当固相载体联肾上腺素等对抗体反应活性的影响可以被自由基清
除剂抑制联合应用SOD和Cat几乎完全抑制儿茶酚胺
的作用(P<0.05)。为了排除SOD和Cat的非酶促作用
用高温灭活的酶作为对照(表3)。
表3自由基清除剂对儿茶酚胺造
Tab3Freeradicalscavengersinhibitcat
组别
Group
阳性血清+肾上腺素+bSOD+bCat
Positive serum+epinephrine+bSOD+bCat
阳性血清+去甲肾上腺素+bSOD+bCat
Positive serum+noradrenalin+bSOD+bCat
阳性血清+肾上腺素+SOD+Cat
Positive serum+epinephrine+SOD+Cat
阳性血清+去甲肾上腺素+SOD+Cat
Positive serum+noradrenalin+SOD+Cat
注：SOD和Cat的浓度分别为32 U·mL-1。bSOD+bCat为100℃灭活
*与未加（SOD+Cat）的样本相比差异显著（P＜0.05）
Note:Both the concentration of superoxide dismutase and catalase are 32
is expressed by P/N ratio.*Means it is statistically significant compared
n
16
16
16
16
讨论
近年来，活性氧的作用再一次被研究人员高度关
注[4]。现在的研究表明：很多损伤机制中都有活性氧
的参与[5～7]。儿茶酚胺，包括去甲肾上腺素和肾上腺
素，其分子结构的特点使其羟基具有一定的还原能力
当与氧接触时，它们就可以使氧还原，儿茶酚胺被氧
化。这一过程也就是所谓的“自氧化”。自氧化，在一定
条件下会导致所谓“单电子还原”，从而产生超氧阴离子
等活性氧。产生的活性氧可以进一步与生物大分子，如
蛋白等作用，使蛋白的三级结构，甚至一级结构发生变
化，从而影响蛋白的活性和功能。本实验表明：肾上腺
素可以造成红细胞脂质过氧化程度的增加。这一结果虽
然是体外实验得到的，但它将对阐明儿茶酚胺在体内的
生物学作用无疑是有提示作用的。Yun-Ching等[8]最近
也报道了去甲肾上腺素的致凋亡作用。儿茶酚胺孵育抗
体所导致的抗体活性的改变令人感兴趣。由于联合应用
自由基清除剂SOD和Cat几乎可以完全抑制肾上腺素和
去甲肾上腺素的这一作用，因此起关键作用的是氧自由
基。我们推测：肾上腺素和去甲肾上腺素通过自氧化所
产生的氧自由基攻击抗体，导致抗体表面活性部位暴露
很可能是造成这一结果的原因。本实验仅是初步的研
究，其中的机制尚有待进一步探讨，深入研究其作用
可能是很有意义的。虽然肾上腺素等孵育的抗体可以使阳性血清的酶联
反应活性增强，但它对阴性血清并无显著作用，并且联
合应用SOD和Cat对后者也无显著作用。
