[点击浏览该文件:活性氧对神经母细胞株SH_SY5Y细胞L型钙通道电流的影响.rar] 神经元细胞内钙超载是脑缺血导致神经元发生
不可逆性损伤的重要环节[1~3],其发生与细胞外钙
内流和胞内钙释放密切相关;在胞外钙内流中,细胞
膜钙通道可能起着关键作用。氧自由基是脑缺血损
伤的主要因素,参与了细胞内钙超载的发生[4~6],
但其确切机制尚有待深入研究。本实验在神经母细
胞株SH-SY5Y细胞体外培养的基础上,采用膜片
钳全细胞记录技术,观察了活性氧H2O2对SH-
SY5Y细胞L型钙通道电流(ICa,L)的影响,旨在进
一步阐明氧自由基在脑缺血性损伤中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
胰蛋白酶、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEP-
ES)、乙二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)、河
毒素(TTX)、氧化四乙胺(TEA-Cl) CsCl、Na2ATP
均为美国Sigma公司产品;胎牛血清、DMEM为美
国GIBCO公司产品;其他试剂为国产分析纯。
1.2 细胞培养
SH-SY5Y细胞株经1.25 g/L胰蛋白酶消
后,用含有体积分数0.15胎牛血清的DMEM培养
基制成细胞悬液,接种在35 mm培养皿中。培养箱
内充以体积分数0.05的CO2和体积分数0.95的
空气,温度为37℃。
1.3 膜片钳记录
实验选用培养72 h的细胞,在PC-Ⅱ型膜片钳
放大器(华中理工大学提供)上用全细胞方式记录钙
通道电流。记录前将培养皿内的培养基置换成记录
液。记录液由CaCl25 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,
HEPES 10 mmol/L, TEA-Cl 140 mmol/L, TTX
1 nmol/L组成,用1 mol/L NaOH溶液调pH至
7.4。电极由经预处理后的微电极玻璃毛坯(直径
1.6 mm)用电极拉制仪(Nar-ishige,日本)以两步法
拉制而成,灌注电极内液后阻抗为2~5 MΩ。电极
内液由CsCl 120 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EG-
TA 10 mmol/L, MgCl22 mmol/L, Na2ATP
2 mmol/L组成,用1 mol/L KOH调pH至7.3。以
微操纵器(Nar-ishige,日本)小心调节电极末端与细
胞表面轻轻接触后,迅速施加负压,使之与细胞膜形
成高达10 GΩ以上的高阻封接。再施以负压吸破
细胞膜,形成全细胞记录状态,根据需要对串联电
阻和电容进行补偿。然后,在保持电位-40 mV
下,施予150 ms、0 mV除极脉冲,记录ICa,L。并以
阶跃为10 mV,给予-40~60 mV的系列除极脉
冲,记录钙电流,以各电流幅值对相应电位作图得
I-V相关曲线。
1.4 实验分组
实验分为正常对照组(用药前)和H2O2实验组
(给药浓度分别为10、30μmol/L)。于用药前和用
药10 min后在同一细胞上记录实验数据。
2 结 果
ICa,L能够被H2O2明显增强。10、30μmol/L
H2O2浓度依赖性地增加ICa,L峰值,分别使ICa,L峰
值从(886.33±63.49)pA增至(995.67±66.85)pA
和(1 167.66±81.18)pA(图1)。10、30μmol/L
H2O2可使ICa,L的I-V相关曲线下移,在各测试电
压下,电流均有增加,但不改变I-V相关曲线的形
状,最大激活电位在0 mV附近也未改变(图2)。
图1 H2O2对ICa,L的作用
a: Con; b: 10μmol/L H2O2; c: 30μmol/L H2O2
图2 H2O2对钙电流I-V曲线的作用
3 讨 论
SH-SY5Y细胞株来源于人神经细胞瘤,该细胞
繁殖快,细胞形态、生理和系列化功能与正常神经
胞相似,因此该细胞是进行人类神经细胞电生理
研究较为理想的一种细胞模型。H2O2属于活性氧,
在体内可转变成细胞毒性极强的羟基;利用H2O2
作为外源性自由基生成系统,可观察自由基对人体
的影响[8]。
既往的研究已证实在中枢神经系统神经元上存
在L、N、Q、R、T等类型的电压依赖型钙通道,它们
各自有不同的电生理学特征[9,10]。本实验记录的L
型钙通道的开放动力学特征与文献报道一致[11],是
典型的L型钙通道。
缺血低氧可致脑细胞钙超载,而胞内钙超载又
是造成神经元死亡的关键环节。并且,在胞内钙超
载的过程中,电压依赖性钙通道可能发挥着重要作
用;Pisani等[12]在鼠离体脑片的低氧实验中发现,
急性低氧超早期细胞内钙集聚主要是通过L型钙
通道实现的。Werning等[13]的研究也认为L型钙
通道对脑缺血细胞内钙聚集起着重要作用。自由基
作为脑缺血损伤的重要病理因素已被大多数实验证
实[4,14],并且它所引起的细胞损伤与胞内钙超载密
切相关。但氧自由基导致神经元钙超载的确切机
制,特别是它对L型钙通道的影响,目前尚未完全
清楚。因此,澄清这一问题将对进一步阐明脑缺血
损伤机制具有重要意义。我们采用膜片钳全细胞记
录技术观察了活性氧H2O2对L型钙通道离子电流
变化的影响,结果显示H2O2可明显增强ICa,L,且存
在着量效关系,即高浓度(30μmol/L-1)时的影响大
于低浓度(10μmol/L-1)。表明H2O2能够使神经
细胞膜L型电压依赖性钙通道开放增加,Ca2+内流
增多。由此提示H2O2对神经细胞L型电压依赖性
钙通道开放动力学的影响,可能是其导致胞内钙超
载的重要机制之一
