[点击浏览该文件:Tau蛋白在Alzheimers病中的作用研究进展 中国药理学通报 2004.pdf] 阿尔采末病(AD) 是一种神经退行性病变,最近
几年对AD 的研究主要集中在两个标志性病理改变
———老年斑和神经纤维缠结上。这两种损害是病理
性蛋白沉积的结果———细胞外β淀粉样蛋白(Aβ) 沉
积导致老年斑形成; 细胞内自我聚集的高度磷酸化的tau 蛋白则是形成神经纤维缠结的结构基
础。过度磷酸化的丝状tau 蛋白在细胞内聚集是许
多神经变性的特征。这里,我们仅就近年来tau 蛋
白在AD 中的研究进展作一综述。
1 Tau 蛋白结构与功能
Tau 蛋白主要在中枢神经系统神经元的轴突表
达,存在于星形胶质细胞和少突胶质细胞内,在外周
神经系统的神经元轴突也有表达[1 ] 。其亚细胞定位
在细胞质,然而有报道tau 蛋白也在质膜上存在,该
结合通过tau 蛋白的N 末端进行,脯氨酸富含区的
磷酸化则阻止了tau 蛋白的这种结合[2 ] 。
正常人中由于tau 蛋白mRNA 剪接方式的不
同,可表达含352～441 个氨基酸的6 种同功异构
体。tau 分子有四个结构区:氨基末端区;脯氨酸富
含区;微管结合区;碳末端区。其氨基末端长度不
定,可插入额外的外显子,并可以和肝素结合[3 ] ;脯
氨酸富含区包含大量的磷酸化位点,与模体PPX
XP或PXXP 相邻,该模体与包含SH3 结构域的蛋白相
互作用[4 ] ;微管结合结构域包含3～4 个重复序列,
这些重复片段由18 个高度保守的氨基酸残基序列
和13～14 个氨基酸保守序列组成,这一重复序列只在成人脑中表达;碳末端也包含有一个脯氨酸富含
区,存在磷酸化位点。
Tau 蛋白的功能广泛,它能结合并稳定微管系
统,并通过与多种蛋白相互作用来行使其各种功能。
Tau 蛋白的mRNA 富含于少突胶质细胞突起的转折
点、分支点和生长尖端[5 ] ;其参与激活膜上的fyn 是
少突胶质细胞髓鞘形成中重要的一步[6 ] ,这些结果
说明了tau 在促进少突胶质细胞成熟中的作用。tau
蛋白通过结合到142323 蛋白上,间接调节细胞内多
种蛋白的分布和功能[7 ] 。Tau 蛋白与各种磷酸酶和
激酶的结合不仅可以调节自身磷酸化,也可以使这
些磷酸转移酶定位到细胞内对应底物,调节其他蛋
白的磷酸化状态。
在体外培养细胞系中,tau 蛋白可提高神经突触
的生长速率和范围。在鸡背根神经节神经元中,使
用发色团激光选择性破坏tau 蛋白的功能可显著性
抑制突触的生长[8 ] 。从tau 缺陷的小鼠胚胎海马细
胞培养与对照tau 蛋白正常表达组的对比中,观察
到缺陷组轴突伸展的延迟[9 ] 。然而,在tau 基因敲
除小鼠,外显型正常,只在一些小的轴突有微管紊
乱[10 ] ,这提示在轴突生长过程tau 可能并不起唯一
作用。而在tau 和MAP1b 都敲除小鼠,则有显著的
脑组织异常改变伴随神经元层紊乱和轴突形成缺
陷;在两者都敲除的体外培养神经元也有突触生长
的抑制[11 ] ,这些资料提示了tau 和MAP1b 可能协同
调节轴突的生长和神经元的迁移。敲除tau 蛋白的
小鼠有MAP1a 表达增加[12 ] ,说明此缺陷可以被微
管相关蛋白(microtubule associated protein , MAP) 的作
用所代偿。
2 tau 蛋白的病理作用
2. 1 tau 蛋白过度磷酸化 Tau 的磷酸化结构基础
是侧翼的微管结合重复序列和79 个潜在的Ser 和
Thr 磷酸化位点。在正常tau 蛋白,大约只有30 个
左右的位点可以被磷酸化。但实际上成人tau 蛋白
每分子只有223 个位点被磷酸化,tau 磷酸化程度的
增加使tau 结合微管的能力下降。在一个模拟tau
蛋白过度磷酸化( PHP2tau) 的体外实验中, PHP2tau
与微管的结合能力下降, 不能起到微管稳定作
用[13 ] 。微管系统的解体导致轴浆转运的衰退,进而
使轴突退化丢失,这些可能是导致脑萎缩和痴呆症
状的原因。缺失突触的神经元胞体在功能上已经死
亡, 它要在这种状态维持几年直到最终胞体消
失[14 ] 。在细胞长期培养中,PHP2tau 有细胞毒效应,
这一效应是通过细胞凋亡机制来实现的[13 ] 。
Tau 蛋白磷酸化程度由蛋白激酶和蛋白磷酯酶
的活性来调节。体外研究中,tau 蛋白可以被多种蛋
白激酶磷酸化, 例如: CaMKII、cdc2、cdk5、GSK23α、
GSK23β、PKA、PKC 等。最近的研究表明,应激激活
蛋白激酶(stress2activated protein kinase ,SAPK) 家族成
员能在体外磷酸化tau 蛋白, 尤其以SAPK3 和
SAPK4 的作用最强。免疫印迹分析表明SAPK家族
所磷酸化的tau 蛋白的位点正与AD 患者脑中tau 蛋
白磷酸化位点相吻合[15 ] 。另外一个受到广泛关注
的蛋白激酶是糖原合成激酶3β(glycogen synthase ki2
nase 3β, GSK23β) ,又叫做tau 蛋白激酶I (tau protein
kinase I ,TPKI) 。Cdk5 对tau 的磷酸化可以协同提
高GSK23β磷酸化tau 蛋白效率,特别是在Thr231位点
的磷酸化程度可被提高9 倍。激酶家族—微管结合
调节激酶( microtubule affinity2regulating kinase ,
MARK) 对tau 蛋白Ser262的磷酸化也起重要作用,该
位点在AD 病理中磷酸化程度增高。在稳定表达
MARK蛋白的CHO 细胞内瞬时表达tau 蛋白导致微
管系统解体,此结果表明MARK磷酸化tau 蛋白并
降低其结合和稳定微管的能力[16 ] 。tau 蛋白磷酸化
还受磷酯酶调节,Tau 蛋白是蛋白磷酯酶2A(protein
phosphatase 2A ,PP2A) 的底物,PP2A 在AD 病人脑中
活性下降直接导致tau 磷酸化程度升高。另外,
PP2A 活性下降可提高MARK活性,间接促进tau 蛋
白磷酸化。
Sadot 等[17 ]研究了胆碱能信号转导系统与神经
元细胞骨架的关系。在PC12 细胞上转染M1 胆碱
能受体,并以M1 受体特异性激动剂刺激细胞,发现
tau 蛋白磷酸化水平降低。该结果提示了胆碱能活
性降低可能导致tau 磷酸化水平升高。
总之,tau 蛋白磷酸化是一个多因素共同作用的
结果。没有哪一种酶单独作用就可以导致tau 蛋白
磷酸化,慢性氧化损伤和胆碱能信号转导系统也可
能参与其中。对tau 蛋白磷酸化的调节仍需要更深
入的研究去了解和揭示其中的规律。
2. 2 tau 蛋白与Aβ 由于Aβ和tau 是AD 病理改
变中重要的标记性蛋白,两者是否存在相互联系也
引起了人们的广泛兴趣。体外实验中,包含Aβ结构
域的相应的APP 肽段与tau 蛋白结合并形成纤维缠
结;Aβ1228也可直接结合到微管[18 ] 。使用免疫组化的
方法用抗PHF2tau 抗体标记AD 脑中神经突触,PHF2
tau 阳性的神经突触几乎都存在于淀粉样沉淀斑块
中或其周围[19 ] 。这些资料表明了tau 蛋白可以与
APP 特异部位尤其Aβ结构域结合,该改变可能发生
在AD 病理过程中。
也有研究探索了Aβ沉积对tau 蛋白磷酸化的
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影响。吴琪等人在大鼠海马内注射线丝状Aβ,利用
免疫组化染色方法观察神经元Ser202位点磷酸化的
tau 蛋白(PS2022tau) 表达的变化,发现右侧海马注射
Aβ42组双侧海马PS2022tau 的表达明显高于正常组和
对照组。提示Aβ42具有诱导tau 蛋白超磷酸化的效
应[20 ] 。离体实验中,Busciglio 等以纤丝状Aβ40 和
Aβ42分别作用于培养的大鼠胚胎海马神经元和人胚
皮质神经元,结果发现Aβ可引起海马神经元tau 蛋
白Ser202、Ser396、Ser404 磷酸化明显增加,且均位于
神经元胞体树突部位,tau 蛋白不能与微管结合[21 ] 。
Aβ诱导tau 蛋白磷酸化的机制可能与P35 介导
的Cdk5 激活有关。Alvarez 等[22 ]显示在Aβ处理过
的海马细胞有异常的Cdk5 激活,用特异Cdk5 抑制
剂如丁内酯I 或用Cdk5 的反义探针进行预处理,可
以起到对抗tau 蛋白磷酸化和细胞凋亡的作用。洪
道俊等[23 ]以单侧杏仁核注射Aβ25235大鼠AD 模型观
察术后24 h 皮质、海马等脑区就出现P35 的表达增
强,表明Aβ25235杏仁核注射能诱导脑内P35 的表达
增加。P35 及其羧基末端降解产物P25 是Cdk5 的
特异性激活蛋白,而Cdk5 活化后能加强tau 蛋白的
磷酸化。结果提示Aβ导致的脑内tau 蛋白磷酸化
可能部分与P35 介导的机制有关,尤其是在Aβ损伤
早期。
新的研究发现tau 蛋白有抑制细胞成分转运的
作用,这可能导致线粒体逐渐回收至细胞核周围。
由于在AD 病人脑中tau 蛋白水平是正常人的8
倍[24 ] ,如果这种效应在老年痴呆病中发生的话,则
可能有线粒体和过氧化氢酶体的抑制,伴随能量产
生的丢失和活性氧的积累。围绕这个问题Stamer 等
研究了N2a 成神经细胞瘤、大鼠或小鼠的大脑皮层
神经细胞的原代培养、鸡视网膜神经节细胞中tau
蛋白过度表达的效应,发现这些细胞虽然有完整的
微管体系,但他们的线粒体和过氧化酶体系缺陷,细
胞生长迟滞,对氧化应激敏感[25 ] 。同时,自Golgi 体
来的囊泡转运到轴浆被抑制,这样携带β淀粉样蛋
白前体的囊泡就滞留在细胞体,使得毒性Aβ片段产
生增加[26 ] 。
Rapoport 等[27 ]从另一方面验证了tau 蛋白对于
Aβ发挥毒性所必不可缺的作用。分别取野生型、tau
基因敲除纯合子、转入人类tau 基因的tau 先天缺乏
鼠的胚胎海马神经元培养4 wk 后,与Aβ纤维共孵
育。24 h 后,tau 敲除的海马神经元没有观察到变性
坏死,甚至96 h 后,仍有0185 ±0107 的神经元呈现
出正常的形态特征。而野生型的海马神经元细胞在
加入Aβ共同孵育24 h 后有明显突触变性,96 h 后
0190 ±0105 的突触显示完全变性,0187 ±0107 的神
经元坏死。这一结果表明tau 蛋白在Aβ纤维沉淀
引起突触变性的机制中可能起到关键性的作用。在
tau 缺失神经元重组表达人类tau 蛋白,可使神经元
对Aβ的毒性恢复敏感性。该研究证实在tau 基因
敲除和重组人tau 基因转基因鼠的海马神经元,Aβ
处理使微管相关蛋白激酶(microtubule associated
protein kinase ,MAPK) 激活。该研究还进一步揭示了
在tau 基因敲除的神经元,稳定型微管明显降低,有
活力的不稳定微管增多。在用Taxol 处理过的tau
基因敲除神经元, Taxol 可诱导稳定型微管大量增
加,此处理使tau 缺失神经元对Aβ毒性敏感性增
加。该结果表明tau 蛋白的存在诱导稳定型微管增
加反而导致Aβ毒性,进而提出了tau 蛋白在AD 发
病过程中作用的又一新观点。但是这一结果也有很
多具体问题有待进一步研究证实。
尽管不少研究对tau 与Aβ的相互作用进行了
探索,开拓了AD 病理研究的新方向,然而至今尚无
一个得到公认的定论。
3 Tau 蛋白在AD 诊断中的应用
随着AD 治疗研究的进展,现在可以使用Aβ42
肽疫苗或γ2分泌酶抑制剂来干预病程的进展。由
此,早期准确性诊断AD 就显得尤为重要,它为AD
病患者及其家庭提供了对抗疾病的机会。
由于tau 蛋白在AD 病理中潜在的重要作用,脑
脊液(cerebrospinal fluid ,CSF) 中增加的tau 蛋白水平
成为AD 可能的生物标记。日本的一些科学家做了
大规模多中心多对照组的统计研究,得出具临床意
义的tau 蛋白水平为375μg·L - 1 。这一标准可确定
0160 的AD 病人,并排除0190 的非AD 受试者[28 ] 。
为了进一步提高准确性和特异性,胡元元等[29 ]建立
了ELISA2双酶底物循环荧光法测定CSF 中tau 和磷
酸化tau 蛋白,发现AD 病人中CSF tau 和p2tau 含量
均显著高于VD 和非痴呆性神经系统疾病及正常对
照者,p2tau 的显著升高仅见于AD 病人。因此使用
p2tau/ 总tau ≥0133 作为AD 的诊断标准大大提高
AD 诊断的准确性、特异性。另外,上皮细胞内的tau
蛋白水平与在CSF 中的tau 蛋白水平有正相关。并
且在AD 患者中这种tau 的含量显著高于其他对照
组,上皮细胞内的tau 水平在年轻发病的AD 病人中
高于老年发病的AD 病人。由此,口腔黏膜上皮细
胞内tau 蛋白水平可能会对诊断AD 有帮助[30 ] 。
4 通过tau 蛋白途径的疾病模型建立及其在药物
发现中的应用
随着对tau 蛋白的功能和其在AD 发病机制中
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作用的了解加深,其意义不仅在于临床诊断的应用
中。发展tau 蛋白途径的动物和细胞模型,将有助
于更清楚的研究病理性tau 蛋白的形成、作用,并找
到新的治疗策略。
可考虑用于tau 蛋白途径的高通量筛选体外模
型有: ①细胞水平测定tau2微管结合力。该途径可
发现通过多个环节影响tau 与微管结合的化合物,
比如通过抑制激酶、激活磷酸酶、影响脯氨酸异构化
等途径。②细胞水平测定tau 磷酸化。比较难,因
为首先tau 蛋白在细胞间存在不均一表达,仅仅有
磷酸化还不够,还要考虑是否真正形成了聚集。③
体外检测tau 激酶抑制剂。这条途径需要选定合适
的激酶作为靶点,并且要达到特异性强不影响激酶
的正常功能。④体外检测tau 自我聚集。不仅需要
tau 的聚集模型符合疾病机制,这一tau 聚集还要发
挥毒性作用。
有人在SH - SY5Y细胞建立了体外tau 蛋白磷
酸化自身聚集细胞模型,发现磷酸化和氧化过程同
时存在是形成tau 蛋白聚集,纤维细丝形成的必要
条件[31 ] 。该实验发现tau 磷酸化能促进tau 聚集,但
不是唯一条件,另一重要因素是HNE 的作用。HNE
是脂质过氧化的产物,曾被发现在体内与NFT 形成
有关[32 ] 。有趣的是,也有报道指出脂质过氧化导致
淀粉样蛋白的形成[33 ] 。这样,HNE 在AD 疾病病理
性结构形成中可能起到一定作用。该模型提供了新
的治疗AD 的思路。
最近有人深入研究了诱导tau 蛋白表达来建立
tau 病理的细胞模型,因为tau 自我聚集是浓度依赖
性的,并且稳定转染不可能表达高水平的tau 蛋白,
另外可能会有MT 的结合,因此他们在人源性神经
胶质瘤(H4) 和神经元细胞系[BE(2) - M17D]建立
条件性转染作为细胞模型,广泛研究了在H4 细胞
表达4R0N tau2野生型、V337M、或R406W突变tau 蛋
白。R406W转染体的sarkosyl 不可溶性比野生型和
V337M转染体更大。免疫电镜显示这些不可溶的
tau 纤维丝直径15～25 nm ,与AD 和FTDP217 疾病中
的缠结纤维很相似,该结果说明条件性转染R406W
可形成聚集性tau 蛋白,与AD 中tau 蛋白病理过程
相似[。34 ]
尽管tau 蛋白纤维形成是AD 和tau 疾病的中心
事件,但是由于缺乏可行的神经元纤维变性的体内
模型,因此NFT 形成的过程并没有很好的被人们所
理解。Garth 等人将人类标记tau 基因注射到七鳃鳗
大脑特定神经元,这些特定神经元慢慢表达人类tau
蛋白。在原位反复显影,发现在这些神经元所表达
的人类tau 蛋白有过度磷酸化并形成纤维缠结,逐
步替代正常细胞骨架,导致渐进性神经纤维变性,与
AD 的细胞病理过程相似。他们借助该模型发现一
个酯溶性,小分子量化合物N3 在体外可对抗tau 神
经纤维形成,在七鳃鳗体内模型实验中可以显著对
抗tau 的过度表达引起的神经纤维变性[35 ] 。这一体
内实验证实了tau 蛋白纤维细丝形成在神经元纤维
变性疾病中起病因作用,并指出寻找抑制tau 纤维
细丝形成的化合物在AD 治疗中是有前景的。
综上所述,随着tau 蛋白研究的不断进展,对理
解AD 病理及发病机制会有更多的帮助。更多成熟
的tau 蛋白疾病模型的建立,为寻找抗AD 药物开启
了更多的靶点,我们期待AD 药物治疗有更多新的
突破。
