国内外学者对自由基的作用和影响、产生和反
应机理以及测定方法等进行了多方面的研究。为了
筛选抗衰老药物及研究抗衰老机理的需要,我们首
次采用脂质过氧化法测定自由基含量。利用自由基
可以启动脂质过氧化反应生成最终产物丙二醛的原
理,在体外使组织中的自由基与磷脂混合,经过系列
反应,最终生成丙二醛[1 ] 。在酸性条件下加热,丙二
醛可以与硫代巴比妥酸反应生成红色物质,用正丁
醇提出该有色物质后,在532 nm 比色,测定丙二醛
含量[2 ] ,再以反应前的丙二醛含量作对照,即可测得
自由基的含量。
1 实验部分
1. 1 仪器、试剂和动物
UV - 120 - 02 可见紫外分光光度计(日本岛津
公司) ; TG3283 光学读数分析天平(湘仪天平仪器
厂) ;pH - 25B 型酸度计(上海大中分析仪器厂) ;
TGL - 16B 离心机(上海安亭科学仪器厂) ;H - 1 微
型混合器(上海青浦沪西仪器厂) 。1 ,1 ,3 ,3 - 四甲
氧基丙烷(Sigma 公司) ;硫代巴比妥酸(上海化学试
剂公司) ; 大豆卵磷脂(上海伯奥生物科技有限公
司) ;正丁醇(成都化学试剂厂) ;水为去离子水。昆
明种小鼠(华西实验动物中心) 6 只, ♀,年龄大于12
个月,体重49 ±4 g ;健康Beagle 犬(上海新冈动物实
验场) 6 只, ♀♂各半,体重7. 0 ±0. 5 kg。
1. 2 方法与结果
1. 2. 1 试液的配制 精密称取1. 6429 g 四甲氧基
丙烷,加水溶解并定容至100 ml ;用移液管从中吸取
1. 0 ml ,加水稀释并定容至100 ml ;摇匀后用移液管
从中吸取4. 0 ml ,加pH4. 0 醋酸- 醋酸盐缓冲溶液
稀释并定容至100 ml ,得41. 35 nmol·ml - 1的四甲氧
基丙烷标准溶液。称取硫代巴比妥酸5. 0 g , 用
pH4. 0 醋酸- 醋酸盐缓冲溶液500 ml 溶解,超声助
溶,得10 mg·ml - 1硫代巴比妥酸对照溶液。称取卵
磷脂1. 55 g ,用无水乙醇- 乙醚(1∶3) 混合溶液250
ml 溶解,超声助溶,得6. 2 mg·ml - 1卵磷脂溶液。
1. 2. 2 脂质过氧化法测定自由基含量的方法 用
移液管精密量取组织匀浆的上清液0. 4 ml ,置20 ml
具塞试管中,各管加pH4. 0 醋酸- 醋酸盐缓冲溶液
0. 6 ml ;加脂质液0. 5 ml ,室温放置反应10 min ,加硫
代巴比妥酸溶液3. 0 ml ,混合均匀;沸水浴恒温反应
30 min 后,取出,置冷水中冷却至室温;加正丁醇3. 5
ml ;漩涡振荡30 s 混合均匀;全部倒入10 ml 塑料离
心管中,4 ×103 r·min - 1离心15 min ;取上清液于532
nm测吸光度A2 。同时,各有一个对照管,不加脂质
液而加无水乙醇- 乙醚0. 5 ml ,其余操作相同,测得
吸光度A1 。并且以不加组织匀浆、不加脂质液管作
为空白调零。自由基浓度的计算式: C = ( A2 - A1) /
εl
×1. 5/ 0. 4。其中A2 - A1 为扣除组织匀浆原有丙
二醛产生的颜色,得自由基反应后产生的丙二醛的吸
光度;ε为丙二醛的摩尔吸光系数,通过标准曲线方程
计算得到; l 为光路长度1 cm;1. 5/ 0. 4 为稀释倍数。
1. 2. 3 标准曲线的制作 精密量取标准品溶液0、
0. 3、0. 6、0. 9、1. 2、1. 5 ml ,分别置于20 ml 具塞试管
中,各管用pH4. 0 醋酸- 醋酸盐缓冲溶液补全至
1. 5 ml ;加硫代巴比妥酸溶液3. 0 ml ,其余按“11212”
项下方法,测定532 nm 处的吸光度。以吸光度为纵
坐标,四甲氧基丙烷浓度为横坐标绘制标准曲线,回
归方程为: A = 0. 0285 C - 0. 0443 ( r = 0. 9970) , 在
8. 27～41. 35 nmol·ml - 1范围内,吸光度与浓度呈良好
的线性关系。
1. 2. 4 方法的精密度 取高、中、低3 个浓度的标准
品溶液各3 份,同一天内按“11213”项方法操作,测定
吸光度,并计算日内精密度分别为0. 81 %、2. 72 %、
7. 99 %。取高、中、低3 个浓度的标准品溶液各3 份,分
3 天分别按“11213”项方法操作,测定吸光度,计算得
日间RSD 分别为3. 71 %、5. 06 %、6. 67 %。
1. 2. 5 回收率试验 精密量取已知浓度的混和血
浆0. 3 ml ,分别加入标准品溶液0. 4、0. 8、1. 2 ml ,再
用pH4. 0 醋酸盐缓冲溶液补全至1. 5 ml ,按“11212”
项测定吸光度,计算回收率(表1) 。
表1 回收率实验结果( n = 3)
Table 1 The results of recovery test ( n = 3)
Added/ nmol Detected/ nmol Recovery/ % X/ % RSD/ %
4. 136 4. 002 96. 76 97. 95 2. 45
3. 984 96. 32
4. 168 100. 77
8. 272 8. 356 101. 01 99. 66 1. 18
8. 170 98. 76
8. 208 99. 22
12. 408 12. 355 99. 57 100. 68 1. 03
12. 517 100. 87
12. 608 101. 61
1. 2. 6 小鼠体内各组织自由基浓度和总量的测定
小鼠眼球取血后处死,取小鼠心、肝、脾、肺、肾、
脑、及后腿肌肉一块,分别精密称重。取适量组织精
密称重后,加0. 05 mmol·ml - 1 pH7. 4 的磷酸盐缓冲
溶液(约0. 2 g 组织加1. 0 ml 缓冲溶液) ,匀浆。分
别置5 ml 塑料离心管中,3 ×103 r ·min - 1 离心10
min。取上清夜,按“11212”项测定,计算小鼠体内各
组织中自由基的浓度和总量,并分别作柱形图(图
1、图2) 。可见小鼠各组织的自由基含量按浓度从
高到低顺序为:心脏> 脾> 肺> 肝> 肌肉> 肾> 脑;
按组织中自由基总量排序为:肝> 心脏> 脾> 肺>
肾> 脑,与文献报道[3 ]的结果相符。
图1 小鼠体内各组织自由基浓度分布柱形图( n = 6)
Fig 1 The distribution column diagrams of free radicals concentration
in mice tissues( n = 6)
1. 2. 7 超过氧化物歧化酶(SOD) 对Beagle 犬血浆
中自由基含量的影响 给Beagle 犬口服SOD 溶液
(含SOD 50 mg) 后,在多个时间点于右后下肢静脉采
血,保存于肝素化塑料离心管中,5 ×103 r·min - 1离
心5 min ,分离血浆。按“11212”项下方法测定,计算
血浆样品中自由基浓度随时间的变化(图3) ,Beagle
犬口服SOD 溶液后血浆中自由基的水平明显下降,
2. 5 h后降至最低值,此后逐渐缓慢回升,24 h 后血
浆中自由基含量仍未恢复原有水平。
图2 小鼠体内各组织自由基总量分布柱形图( n = 6)
Fig 2 The distribution column diagrams of free radicals content in
mice tissues( n = 6)
图3 Beagle 犬口服SOD 溶液后血浆中自由基含量的变化( n = 6)
Fig 3 Curve of free radicals concentration in Beagle dog plasma after
being given SOD( n = 6)
2 讨论
电子自旋共振(ESR) 是目前直接测定自由基的
主要方法,其测定过程需与被测自由基的产生同步
进行。因此,使样品的制备及检测操作受限,且一定
时间内能够测定的样品数量有限。脂质过氧化法只
需要一台可见分光光度计,所用试剂磷脂和硫代巴
比妥酸价廉易得,并且可以同时平行测定多个样品,
方法的线性、精密度和回收率均高,能够满足实验室
抗衰老药物筛选的需求。硫代巴比妥酸在醋酸缓冲
溶液中溶解速度较慢,需超声助溶;实验中时有沉淀
出现,应振摇或超声使其溶解再进行测定。磷脂易
溶于乙醚,难溶于乙醇和水。配制时,应先使脂溶于
乙醚,再缓慢加入乙醇中。
按照机体衰老的自由基学说[4 ] ,选用体内自由
基含量较高的大龄小鼠作为研究对象。使用脂质过
氧化法测定小鼠各组织中自由基浓度和总量的分布,
其结果与文献[3]相符。SOD 是具有特异性清除自由
基的抗氧化酶[5] 。给Beagle 犬口服SOD 溶液后,测得
其血浆中自由基含量迅速降低,于2. 5 h 达到最低水
平并逐渐回升,24 h 后仍低于初始自由基水平,可见
脂质过氧化法可以反应体内自由基含量的变化
