丙二醛(malondialdehyde ,MDA) 是脂质过氧化 的最终产物,它的浓度可以反映脂质过氧化程度。 已有几种方法用于MDA 测定,分光光度法〔1〕、荧 光法〔2〕和高效液相色谱法〔3〕。分光光度法灵敏度 较低,已报道的荧光法〔4〕由于萃取溶剂不同或按 照原文献方法无混匀器使萃取不完全而造成结果 不准确,高效液相色谱法需昂贵仪器。针对上述 方法的不足,本文在原文献荧光法测定基础上提 出一种简单的新方法, 应用于生物样品中微量 MDA 的含量分析取得满意结果。 1 材料 960MC荧光分光仪(上海精密科学仪器有限 公司) ;地塞米松磷酸钠注射液(鄂北制药厂) ;角 叉菜胶(辽宁省药物研究所) ;硫代巴比妥酸(北京 化工厂) ;四乙氧基丙烷( Fluka 产品) 。其他试剂 均为分析纯。酸576. 6 mg 加入80 ml 水,60 ℃以下加热溶解, 冷却。用双蒸水稀释至100 ml ,再加入等体积的冰 醋酸混匀,即得20 mmol·L - 1硫代巴比妥酸溶液。 四乙氧基丙烷对照液:精密吸取四乙氧基丙 烷0. 2 ml ,置于100 ml 容量瓶中,加甲醇至刻度, 混匀,得9 mmol·L - 1四乙氧基丙烷储备液,4 ℃保 存。临用前用双蒸水稀释至所需浓度,即得四乙 氧基丙烷系列对照液(0. 56 ,1. 24 ,2. 24 ,4. 48 ,8. 96 μmol·L - 1) 。 Wistar 大鼠由甘肃省医学科学院实验动物中 心提供,清洁级,合格证14 - 004 号。 2 实验方法与结果 2. 1 标准曲线的绘制 分别取四乙氧基丙烷对照液0. 1 ml ,置于具 塞离心试管内,加0. 6 mmol·L - 1盐酸溶液2 ml 和 20 mmol·L - 1硫代巴比妥酸溶液1 ml ,混匀。90~ 100 ℃水浴反应1 h ,冷却。再加入4 ml 正丁醇溶 液,密塞,充分振摇1 min ,3000 ×g 离心10 min ,置 4 ℃冰箱过夜。待完全分层后取适量上清液,以 λex = 520 nm ,λex = 546 nm ,同样方法处理的蒸馏水 为空白管作荧光分析。以X 为横坐标,表示对照 溶液浓度(μmol·L - 1) ,以Y为纵坐标,表示标准管 与空白管荧光值之差,用最小二乘法计算得回归 方程和相关系数为: Y = 2. 2204 X + 0. 0708 , r = 0. 9996 , P < 0. 001 说明线性关系良好。上述正丁醇萃取液4 ℃冰箱 放置0 、3 、6 、9 h 后,在λex = 520 nm ,λex = 546 nm 条 件下的荧光值基本无变化。 2. 2 样品溶液的制备及测定 取160~200 g 体重wistat 大鼠,随机分3 组, 空白对照组、模型组和地塞米松组。肌肉注射地 塞米松,空白对照组和模型组肌肉注射等容积的 生理盐水,12 h 后再给药1 次。末次给药1 h 后, 模型组和地塞米松组腹腔注射10 g·L - 1角叉菜胶 25 mg·kg - 1 。致炎6 h 后断头放血处死,放血时不 断用自来水冲洗伤口,使血液尽量流尽。立即腹 腔注射D - Hanks 液5 ml 灌洗腹腔,用加样器将腹 腔内全部液体吸出,加入塑料离心管内,500 ×g 离 心5 min ,取上清液适量以备MDA 含量测定。腹 腔渗出液中MDA 含量测定按照标准曲线绘制方 法,从“置于具塞离心试管内”同法进行操作,测定 荧光值。依照回归方程计算含量。测定结果见表 1 。 2. 3 回收率试验 取已知含量的样品溶液,分别加入低、中、高3 个浓度的四乙氧基丙烷对照液,按样品含量测定 方法检测,平均回收率为98 % ,RSD 为4. 8 %。 表1 样品中丙二醛测定结果( x- ±s) 组 别 鼠数 (只) 剂量 丙二醛含量/ μmol·L - 1 空白对照组7 ——— 0. 87 ±0. 23 模型组9 ——— 2. 53 ±1. 38 地塞米松组8 2 mg·kg - 1 1. 77 ±0. 55 3 讨论 3. 1 萃取液的选择 由于样品的脂质过氧化物与TAB 反应物 MDA. TBA 为有机化合物,根据相似相容的原则, 选择极性较强的甲醇或正丁醇作为萃取液。本方 法采取甲醇〔5〕作为萃取液,样品的脂质过氧化物 与TAB 反应物MDA. TBA 放置不稳定,3 h 后反 应液颜色变红,而且荧光强度变弱。选择正丁醇 作为萃取液,置4 ℃冰箱过夜后,荧光强度基本不 变,故选择正丁醇萃取。 3. 2 萃取时间的选择 由于没有混匀器或分液漏斗,置于具塞试管 中的反应液充分振摇1 min ,4 ℃冰箱放置12 h ,荧 光强度基本稳定,萃取12 h 可满足要求。 采用分光光度法,反应液不显红色,故不能检 测出样品中微量丙二醛,这可能是分光光度法检 测灵敏度较荧光法低的缘故。本方法简便可行, 不需混匀器或分液漏斗,可获得很好的准确度和 精密度,而且检测灵敏度高,可用于微量丙二醛的 常规分析。
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