神经系统的细胞移植已被用来研究和促进神经
损伤的功能恢复!"#。胚胎干细胞移植到脑脊髓组织的
不同部位可以分化成不同的组织表型!$#， 胚胎组织移
植对神经退行性变、脑脊髓损伤及脑缺血梗塞具有
惊人的治疗作用!%&’#， 但由于伦理和道德问题， 其临
床应用受到了很大限制， 因此选择另一干细胞源替
代胚胎组织用于细胞移植治疗神经系统疾患非常重
要。人脐血含有丰富的多能干祖细胞， 具有增殖能
力强、来源丰富、采集方便及配型不完全相同亦可
利用等优点。虽然脐血干细胞移植已广泛用于血液
病的治疗!(&)#， 但移植到中枢神经系统是否可以存活
和发育尚不清楚。本研究移植人脐血干细胞到人为
损伤的大鼠脊髓后， 观察移植细胞是否可以在脊髓
损伤的局部微环境存活、表达神经特异蛋白及是否
促进脊髓损伤的行为和功能恢复。
材料和方法
试剂和仪器*+%’,细胞分离试剂盒为-.*/ 公
司产品，(! 溴脱氧尿核苷（012324526781949:5& ;148）
购自<2=>5 公司， 小鼠抗;148 单克隆抗体购自;!+
公司，小鼠抗神经元核抗原（:5812:?@ :8=@5?1 AB5=9C9=
B12D59:& E58E）单克隆抗体及小鼠抗神经胶质元纤维
酸性蛋白（F@9?@ C9019@@?17 ?=949= B12D59:& GH.I） 单克
隆抗体均购自*>539=2: 9:D51:?D92:?@ 公司。激光扫描
共聚焦荧光显微镜为;92!<?4 公司型号J@73B8A KLM"
产品，流式细胞仪为*28@D51 公司型号为H.*/!N?:D?F5
产品。
动物及分组$) 只健康O9AD?1 大鼠， 购自军事
医学科学院第四研究所，体重$PPQ%PP F，雌雄不限，
随机分成脐血造血干细胞移植组（! " "%）和对照组
（! " "$），对照组中" 只大鼠因术后伤口感染死亡。
脐血!"#$%细胞的分离和制备-.*/ 试剂盒分
离*+%’,细胞，取正常分娩的脐血，首先用淋巴细胞
分离液（H9=2@@）分离间层细胞制备单个核细胞，按试
剂盒操作步骤加*+%’ 抗体结合磁珠试剂孵育%P 39:，
把细胞悬液加到分选柱缓冲液洗脱，最后收集*+%’,
细胞， 再重复一次。细胞记数后培养在K-+- 培养
液中并附加"PR胎牛血清。流式细胞仪检测*+%’,
细胞纯度。移植前M$ > 加白介素!% (P !F" 3@、白介
素!) "PP !F" 3@、干细胞因子"PP !F" 3@ 诱导*+%’,
细胞进入细胞周期，同时加;148 标记（$P !32@" S），
;148 在细胞/ 期可以标记+E. 作为示踪!M#， 流式细
胞仪检测;148 标记阳性率，记数、备用。
动物模型制备采用戊巴比妥行腹腔麻醉， 在
解剖显微镜下按;15F3?: 法制作脊髓半切模型， 从
背部纵向切口， 暴露TU!V 硬脊膜， 以正中血管为
界，用眼科剪行脊髓左半侧切断!U#。为保证完全切断，
用外科U!P 单尼龙丝线围绕全部左侧脊髓作一环状，
环内组织完全切断。
细胞移植脐血造血干细胞移植组用W?39@D2:
微量注射器将脐血造血干细胞缓慢注射到脊髓损伤
的头尾侧两个区域，每个区域注射% !@，每!@ 含细
胞数UP PPP 个以上； 对照组在脊髓损伤部位头尾两
侧分别缓慢注入I;/ 缓冲液% !@，注射后留针( 39:，
以避免细胞外渗。
运动功能评价移植组和对照组所有大鼠在术
前和术后$’ >、"、$、%、’ 周观察下肢活动情况，
对照改良T?1@2X 评分标准进行神经运动功能评价!U#。
比较神经运动功能评分是否具有显著性差异。
组织学和免疫组化测定术后观察’ 周后， 应
用’R多聚甲醛经心灌注处死动物， 取出受损部位
脊髓， 固定、石蜡包埋、连续) !3 切片。用常规
苏木精和伊红染色观察脊髓半切组织损伤及修复。
采用免疫组化法检测;148 标记脐血造血干细胞的存
活、生长、分化的变化!V&"P#， 石蜡切片逐级脱蜡至
水，$ 32@" S W*@ 变性" >， 中和"P 39:， 血清封闭
后， 加入抗;148 单克隆抗体（稀释"Y"PP） ’Z过
夜，经辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠KFG （W,S）二抗
室温" >，二氨基联苯胺显色，最后苏木精复染。
&’() 阳性细胞的分化应用免疫双重荧光染色
法测定脐血造血干细胞的E58E 和GH.I 的表达情
况， 判定其向神经细胞分化的能力， 石蜡切片首先
用第一抗体抗;148 单克隆抗体处理，经上述处理后
加异硫酸罗丹明标记山羊抗小鼠KFG （W,S）二抗处
理" >， 然后用第$ 个单克隆抗体抗E58E （稀释" Y
$PP） 或GH.I （稀释"Y"PPP） 单克隆抗体室温处理
" >， 加异硫氰酸荧光素（C@8215A=59: 9A2D>9?=7?:?D5&
HKT*） 标记兔抗小鼠KFG （W,S） 二抗作用" >。阴
性对照不加第$ 个单克隆抗体E58E 或GH.I。最后
用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察， 激发光束分别
在."/ 和"@@ AB， 记数双荧光标记细胞占单荧光标
记4&67 阳性细胞的百分数。每个切片至少记数!*
个视野，计算平均数。
统计学处理采用独立样本$! 检验， 数据以均
值C 标准差表示。
结果
脐血%&’()细胞的分离和制备结果D35E 试剂
盒分离58/"F细胞，流式细胞仪检测58/"F细胞纯度达
G9+9/: （图,）。4&67 标记阳性率为HG+HG:
运动功能评价结果在脊髓半切术前及术后!" #
检查移植组和对照组改良$%&’() 评分均无显著性差
异（! " *+,*）， 术后, - " 周两组改良$%&’() 评分比
较具有显著性差异（! # *+*.）。移植组较对照组神
经运动功能恢复更加明显， 尤其! 周后移植组改良
$%&’() 评分均值均超过" 分，接近正常（图/）。
组织学和免疫组化测定结果常规012 组织学
检查， 以背部正中血管及中央沟、裂为界， 动物模
型脊髓左侧可见灰质区神经细胞变性、减少， 伴星
形胶质细胞增生， 白质纹理紊乱， 证实脊髓左侧半
切较彻底（图"3）。" 周后神经细胞减少， 坏死区
内神经细胞消失（图"4）， 对照组较移植组星形胶
质细胞增生明显， 但无显著性差异（图"5）。免疫
组化酶标法检测在脊髓病理切片中发现4&67 标记人
脐血干细胞（图"8）。
!"#$ 阳性细胞的分化结果利用激光扫描共聚
焦显微镜通过免疫双重荧光染色法检测大约9: 4&67
阳性细胞表达;<3= 表型（图.3， .4）， 大约!:
4&67 阳性细胞表达>?7> 表型（图.5，.8）。阴性
对照没有发现免疫交叉反应。
讨论
本研究移植人脐血干细胞直接到人为损伤的大
鼠脊髓部位明显地改善行为和功能的缺陷， 免疫组
化法在脊髓中发现存活的!"#$ 标记人脐血干细胞，
!"#$ 在细胞% 期可以标记&’( 作为示踪。免疫荧
光双标法探索大约)* !"#$ 阳性细胞表达+,(- 表
型， 大约.* !"#$ 阳性细胞表达’/$’ 表型。结果
与应用骨髓间质干细胞移植实验结果类似0112。34566
等072多次应用骨髓细胞治疗脊髓损伤或脑缺血大鼠
模型， 可明显提高神经功能恢复， 移植细胞可在中
枢神经系统微环境中存活并有小部分分化为神经细
胞。
脐血干细胞移植促进脊髓损伤的神经功能恢复，
其内在修复机制尚不清楚。本研究结果与89&5:;<#0.2
实验结果类似， 所不同的是移植脐血干细胞与对照
组比较1 周后就可以明显地改善大鼠行为缺陷， 而
89&5:;<# 实验结果是移植胚胎干细胞. 周后才可明
显地改善大鼠行为缺陷， 具体原因尚不清楚。脊髓
损伤最直接的修复机制是移植细胞整合到宿主脊髓
部分补偿损失的神经细胞功能， 作为连接损伤脊髓
两断端的桥状结构， 支持并引导宿主轴突再生穿越
损伤区； 或作中断结构与再生轴突构成突触联系，
关于修复机制还需要进一步实验验证。同许多其
他01.=1>2 的实验一样， 另外1 个可能的修复机制是移
植人脐血干细胞到人为损伤的大鼠脊髓， 提供! 个
营养因子的细胞源， 通过产生和分泌细胞因子刺激
内源性神经系统的修复机制。生长因子是! 个分子
信号，可以调节机体细胞生存、增殖和分化"!#$。应用
外源性神经生长因子可以限制神经损伤的范围和促
进功能恢复"!%$。脐血干细胞可以产生和分泌集落刺
激因子、血小板生成素和白介素!!!， 在神经组织
的增殖和分化过程中发挥重要作用。
本研究首次脊髓内移植人脐血&’(#)干细胞治
疗脊髓损伤， 结果表明可以促进神经功能恢复。脐
血干细胞易于获得、费用低廉， 是治疗脊髓损伤的
! 个很好的细胞源，具有广阔的临床应用前景。
