【摘要】 目的 研究人脐带分离的间充质干细胞向神经细胞分化的可能性。方法 将剔除动 静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞;经传代培养、细胞周期分析、流式细胞检测后, 再以不同方案诱导向其神经细胞分化,并以免疫荧光和RT2PCR方法进行鉴定。结果 培养5 - 7d 后,有细胞从组织块中游出。细胞传代培养达23代后无明显的形态和增殖能力改变。细胞周期分析 表明80%以上的细胞都处于G0~G1期。流式细胞检测表明这些细胞表达CD13、CD29、CD44、CD90、 CD105和CD166等MSCs标志物。经神经分化诱导后,部分细胞呈现出与神经元或神经胶质细胞类 似的形态;免疫荧光检测表明,第二神经分化诱导方案优于第一方案,其NSE和MBP阳性细胞分别 达8018% ±319%、412% ±113% ,但未能见到GFAP阳性细胞。RT2PCR进一步证实了这些神经标志 物的表达。结论 人脐带间充质干细胞具有向神经细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植 治疗的备选来源。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和 多向分化潜能的细胞。由于作为MSCs经典来源的 骨髓组织,可随老化而致干细胞含量及其增殖能力 显著降低[ 1 ] , 因此,寻找新的MSCs来源有着重要 意义。为此,本文自易于获得、组织来源上较为原始 的人脐带组织中分离的MSCs,对其进行传代培养和 性质鉴定,并探讨其神经分化潜能及神经分化的有 效方法。 资料与方法 11材料:脐带由天津市中心妇产医院获得;流 式抗体除F ITC2CD105 为Ancell公司外,均来自美 国BD公司;碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)和脑 源性神经营养因子(BDNF)购于Pep roTech公司;最 低必须培养基(DMEM) 、胎牛血清( FBS) 、胰岛素2 转铁蛋白2硒( ITS) 、左旋- 谷胺酰胺、胰酶为Gibico 公司产品;丙戊酸、丁羟茴醚、氢化可的松、弗司扣林 和Hoechst 33258、二甲基亚枫(DMSO) 、台盼蓝购于 Sigma公司;青霉素、链霉素购于华北制药有限公 司;神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质原纤维酸性 蛋白(GFAP) 、髓磷脂碱性蛋白(MBP) 、F ITC标记兔 抗小鼠IgG和F ITC标记羊抗兔IgG购于Chemicon 公司, RT2PCR试剂均购于Invitrogen公司,引物由上 海博亚生物公司合成。 21脐带MSCs的分离和培养:取足月妊娠剖宫 产健康胎儿的脐带,以PBS充分冲洗,剔除脐动、静 脉,剩余的间质组织切割成直径约1~2mm大小的 组织块,置DMEM培养液(含10%胎牛血清、25mM 谷胺酰胺、100U /ml青霉素, 100μg/ml链霉素)中, 于含有5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养,以相 差显微镜观察并拍照。 31细胞生物学特性检测:细胞达80%汇合后, 以012%的胰酶/EDTA消化并按1: 2~1: 3的比例 传代。收集第3代细胞,以2 ×104 cells/ well接种 于24孔板,隔日取3孔贴壁细胞,以台盼蓝拒染法 计数活细胞数,以x ±s表示,绘制细胞生长曲线并 计算细胞倍增时间。按同样方法收集第3代贴壁细 胞,以70%酒精于4℃冰箱中固定24h 后, 加入 10μg/ml RNA 酶抑制剂, 37℃孵育30min,再加入 50μg/ml碘化吡啶, 4℃孵育5min后,以流式细胞 仪检测、分析细胞周期。 41细胞表面分子标志检测:收集第3代培养的 第3 - 4天细胞,分别加入PE2CD13、PE2CD29、PE2 CD34、PE2CD38、PE2CD45、PE2CD106、PE2CD133、 PE2CD166、HLA2DR、F ITC2CD44、F ITC2CD90、F ITC2 CD105、F ITC2CD14、F ITC2CD31、F ITC2IgG1 和PE2 IgG1 等各种流式抗体, 4℃冰箱中孵育30min, PBS 充分洗涤后立即送检。 51 神经分化诱导: 取第3 代细胞, 以 5000 cells/ cm2接种于24孔板上。按如下两种方案 进行神经分化诱导:第一方案为,生长培养基中加入 终浓度为10ng/ml bFGF、100ng/mlBDNF和1% ITS 诱导, 10d 后检测NSE、GFAP 和MBP 的表达; 第二方案为, 先以DMEM + 20% FBS + 10ng/ml bFGF预诱导24h,然后改为DMEM + 2% DMSO + 200μmol/L BHA, 6h后再加入25mM KCl、2mM丙戊 酸、10μM弗司扣林、1μmol/L氢化可的松和1% ITS 诱导6h并检测上述标志。 61免疫细胞化学分析:神经分化诱导后,以4% 的多聚甲醛固定,正常兔血清封闭,加入一抗NSE (1: 150)或GFAP (1: 100)或MBP (1: 200)于4℃孵 育过夜, PBS洗涤后加入F ITC标记的兔抗小鼠或羊 抗兔二抗于室温孵育30min, PBS洗涤后Hoechst 33258复染细胞核, Olympus荧光显微镜观察、计数 并拍照。 71RT2PCR检测:取5 ×106 诱导分化后的细胞, 以Trizol常规提取总RNA。逆转录反应为40μl体 系,含2μg 总RNA、25μg/ml的随机引物、015mM dNTP、115mM MgCl2、10mM DTT、1 ×buffer 和 2μlRNA酶抑制剂和2μlM2MLV。PCR反应条件为 NSE ( 94℃, 30 s; 53℃, 30 s; 72℃, 30 s ) 、GFAP (94℃, 30 s; 57℃, 45 s; 72℃, 45 s) 、MBP (94℃, 30 s; 52℃, 45 s; 72℃, 45 s) 。引物序列分别为: NSE (101bp)上游5′2 TTACTTAGGCAAAGGTGTCCTGAA2 3′,下游5′2 GCTTCTCTTGCTCCA CCACAG23′; GFAP (244bp)上游5′2 TGCTCAATGTCAAGCTGGCC23′,下 游5′2 CACATCACATCCTTGTGCTC23′;MBP ( 379bp ) 上游5′2 TTAGCTGAATTC GCGTGTGG23′; 下游 5′2 GAGGAAGTGAATGAGCCGGTTA23′。以2%的琼 脂糖凝胶电泳,照相系统采集图片。 81细胞计数和统计学分析:以10个低倍镜视 野( ×10)下阳性细胞数( F ITC)计算阳性细胞百分 比,以x ±s表示。 结果 11细胞形态:原代培养第3天,有散在的细胞 自组织块中游出(图1 A) ;培养5 - 7d后,大量细胞 由组织块中游出并贴壁,形态为长梭形(图1 B) 。 低密度接种时呈集落式生长,汇合后形成排列紧密、 旋涡状的汇合细胞(图1 C2F) 。 21细胞生物学特性: 细胞达80%汇合后, 以 012%的胰酶/EDTA消化并按1: 3的比例传代。消 化传代后,几个小时内迅速贴壁, 4 - 5d后细胞可再 次达到上述汇合程度(图1E) 。每次传代细胞数约 扩增3 倍。传至第23 代,细胞形态未发生明显变 化,增殖能力也无变化。细胞计数分析表明,细胞的 倍增时间约为30h。细胞周期分析表明, 8011 %的 细胞处于G0~G1期,仅一小部分细胞处于活跃的 增殖状态。 31细胞表型鉴定:流式细胞学检测表明, CD13、 CD29、CD44、CD90、CD105和CD166 等表面标志为 阳性表达,其余标志均为阴性(图2) 41神经分化:神经分化诱导后,部分细胞胞体 收缩成卵圆形或多角形,并出现初级及次级突起,形 态与神经元或神经胶质细胞相似。以NSE、MBP和 GFAP等神经标志物进行免疫荧光检测, 并计数 10个低倍镜下的阳性细胞数发现,第一神经分化方 案诱导后, 3 种标志物的表达分别为1211% ± 216%、918% ±111%和314% ±018%;以第二神经 分化方案诱导后, NSE 和MBP 阳性细胞分别为 8018% ±319%、412% ±113% ,但未能见到GFAP 阳性细胞(图3) 。未诱导的细胞未见MBP或GFAP 阳性细胞,NSE阳性细胞仅为111% ±014% ,且细 胞着色较淡。RT2PCR分析进一步在mRNA水平上 证实了未诱导和诱导的细胞神经标志物表达水平的 差异(图4) 。 讨论 中枢神经系统损伤后的修复与再生一直是神经 科学研究的热点。近年研究表明, 胚胎干细胞 ( embryonic stem cells, ESCs) 、神经干细胞( neural stem cells, NSCs) 和MSCs 均具有神经分化潜 能[ 2, 326 ] , 在移植于动物模型后可改善其神经功 能[ 7212 ] ,因此可作为某些神经系统疾病细胞移植替 代治疗的种子细胞。然而, ESCs尚存在定向分化和 纯化的技术障碍,且面临众多伦理、法律方面的问 题,也有移植后形成畸胎瘤的报道,应用受到一定限 制[ 2, 14 ] 。NSC也受到取材困难、不易获得及伦理、 法律方面问题的影响[ 3, 14 ] 。虽然骨髓MSCs也可改 善脑梗塞、脊髓损伤和外周神经损伤等动物模型的 神经功能[ 9213 ] ,但骨髓源性MSCs细胞有病毒感染的 危险,且随着年龄增长其干细胞数量和增殖能力也 显著下降[ 1 ] 。因此,寻找新的干细胞来源以更好地 应用于某些神经系统疾病的治疗具有重要意义。 前期工作中,我们曾成功诱导脐带血细胞向神 经细胞分化[ 15 ] ,并将人脐带血和骨髓MSCs用于脊 髓半切模型损伤大鼠的实验性治疗[ 16, 17 ] ,取得了令 人鼓舞的治疗效果。本研究中,我们则进一步探索 自人脐带的间质组织中分离MSCs的可靠方法及其 神经分化的有效方案: ⑴在分离方法上,骨髓、脾、 肝等组织或器官的MSCs分离中,通常需要胰酶或 胶原酶消化、流式细胞分选( FACS) 、磁柱细胞分选 (MACS)或反复贴壁等方法以去除其中混杂的造血 细胞和内皮细胞,因此需要时间较长,常会影响细胞 活力且增加细胞污染的机会。本研究中,我们则以 组织块培养法成功地分离出脐带MSCs。结果表明, 此方法不仅简便易行,可更好地保持细胞活力并减 少了污染机会。此外,在培养体系中,几乎见不到造 血、内皮或平滑肌等细胞的混杂。⑵细胞增殖分析 表明,脐带源MSCs的倍增时间约为30h,细胞周期 分析表明80%以上的细胞处于G0~G1期,流式细 胞学检测提示这些细胞表达CD13、CD29、CD44、 CD90、CD105和CD166等表面标志而不表达造血和 内皮细胞标志。但骨髓MSCs不仅含量低(仅占骨 髓单个核细胞的1 /104 ~1 /105 ) ,而且增殖力的变异 也很大,如部分可扩增达15代以上,而另一些却仅 能扩增4代左右。与之相比,脐带MSCs则含量丰 富、易于分离并且在传至23代时仍保持形态和增殖 力的稳定,表明这些MSCs具有良好的自我更新能 力,因此可在较短的时间内获得更多的细胞数量,以 满足临床需求; ⑶免疫荧光和RT - PCR表明,未经 诱导的MSCs不表达少突胶质细胞标志MBP和星 形胶质细胞标志GFAP,神经元标志NSE的阳性细 胞亦十分少见,且表达水平很低。但经神经分化诱 导,特别是在第二方案诱导后,大部分细胞发生明显 的形态改变,并开始表达神经元特异性标志NSE,这 不仅表明了脐带MSCs具有良好的可塑性,也使得 在较短时间内提供足够临床应用的神经元样细胞成 为可能,从而为临床应用奠定了基础。关于这一特 异性转化的机制是否与BHA的抗氧化作用和弗斯 扣林增加细胞内cAMP浓度形成的微环境更有利于 神经元方向的分化尚有待于证实。 总之,本研究证实了人脐带富含MSCs,且可在 体外进行分离、培养、扩增传代,在一定条件下可高 比率地分化为神经元样细胞。加之,脐带易于获得, MSCs含量丰富, 脐带MSCs增殖能力好, 不表达 HLA2DR,无伦理和法律等方面的限制,在神经系统 疾病治疗和修复方面有着广阔应用前景。
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