| 【摘要】 目的 研究人脐带分离的间充质干细胞向神经细胞分化的可能性。方法 将剔除动
静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞;经传代培养、细胞周期分析、流式细胞检测后,
再以不同方案诱导向其神经细胞分化,并以免疫荧光和RT2PCR方法进行鉴定。结果 培养5 - 7d
后,有细胞从组织块中游出。细胞传代培养达23代后无明显的形态和增殖能力改变。细胞周期分析
表明80%以上的细胞都处于G0～G1期。流式细胞检测表明这些细胞表达CD13、CD29、CD44、CD90、
CD105和CD166等MSCs标志物。经神经分化诱导后,部分细胞呈现出与神经元或神经胶质细胞类
似的形态;免疫荧光检测表明,第二神经分化诱导方案优于第一方案,其NSE和MBP阳性细胞分别
达8018% ±319%、412% ±113% ,但未能见到GFAP阳性细胞。RT2PCR进一步证实了这些神经标志
物的表达。结论 人脐带间充质干细胞具有向神经细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植
治疗的备选来源。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)
是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和
多向分化潜能的细胞。由于作为MSCs经典来源的
骨髓组织,可随老化而致干细胞含量及其增殖能力
显著降低[ 1 ] , 因此,寻找新的MSCs来源有着重要
意义。为此,本文自易于获得、组织来源上较为原始
的人脐带组织中分离的MSCs,对其进行传代培养和
性质鉴定,并探讨其神经分化潜能及神经分化的有
效方法。
资料与方法
11材料:脐带由天津市中心妇产医院获得;流
式抗体除F ITC2CD105 为Ancell公司外,均来自美
国BD公司;碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)和脑
源性神经营养因子(BDNF)购于Pep roTech公司;最
低必须培养基(DMEM) 、胎牛血清( FBS) 、胰岛素2
转铁蛋白2硒( ITS) 、左旋- 谷胺酰胺、胰酶为Gibico
公司产品;丙戊酸、丁羟茴醚、氢化可的松、弗司扣林
和Hoechst 33258、二甲基亚枫(DMSO) 、台盼蓝购于
Sigma公司;青霉素、链霉素购于华北制药有限公
司;神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质原纤维酸性
蛋白(GFAP) 、髓磷脂碱性蛋白(MBP) 、F ITC标记兔
抗小鼠IgG和F ITC标记羊抗兔IgG购于Chemicon
公司, RT2PCR试剂均购于Invitrogen公司,引物由上
海博亚生物公司合成。
21脐带MSCs的分离和培养:取足月妊娠剖宫
产健康胎儿的脐带,以PBS充分冲洗,剔除脐动、静
脉,剩余的间质组织切割成直径约1～2mm大小的
组织块,置DMEM培养液(含10%胎牛血清、25mM
谷胺酰胺、100U /ml青霉素, 100μg/ml链霉素)中,
于含有5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养,以相
差显微镜观察并拍照。
31细胞生物学特性检测:细胞达80%汇合后,
以012%的胰酶/EDTA消化并按1: 2～1: 3的比例
传代。收集第3代细胞,以2 ×104 cells/ well接种
于24孔板,隔日取3孔贴壁细胞,以台盼蓝拒染法
计数活细胞数,以€x ±s表示,绘制细胞生长曲线并
计算细胞倍增时间。按同样方法收集第3代贴壁细
胞,以70%酒精于4℃冰箱中固定24h 后, 加入
10μg/ml RNA 酶抑制剂, 37℃孵育30min,再加入
50μg/ml碘化吡啶, 4℃孵育5min后,以流式细胞
仪检测、分析细胞周期。
41细胞表面分子标志检测:收集第3代培养的
第3 - 4天细胞,分别加入PE2CD13、PE2CD29、PE2
CD34、PE2CD38、PE2CD45、PE2CD106、PE2CD133、
PE2CD166、HLA2DR、F ITC2CD44、F ITC2CD90、F ITC2
CD105、F ITC2CD14、F ITC2CD31、F ITC2IgG1 和PE2
IgG1 等各种流式抗体, 4℃冰箱中孵育30min, PBS
充分洗涤后立即送检。
51 神经分化诱导: 取第3 代细胞, 以
5000 cells/ cm2接种于24孔板上。按如下两种方案
进行神经分化诱导:第一方案为,生长培养基中加入
终浓度为10ng/ml bFGF、100ng/mlBDNF和1% ITS
诱导, 10d 后检测NSE、GFAP 和MBP 的表达;
第二方案为, 先以DMEM + 20% FBS + 10ng/ml
bFGF预诱导24h,然后改为DMEM + 2% DMSO +
200μmol/L BHA, 6h后再加入25mM KCl、2mM丙戊
酸、10μM弗司扣林、1μmol/L氢化可的松和1% ITS
诱导6h并检测上述标志。
61免疫细胞化学分析:神经分化诱导后,以4%
的多聚甲醛固定,正常兔血清封闭,加入一抗NSE
(1: 150)或GFAP (1: 100)或MBP (1: 200)于4℃孵
育过夜, PBS洗涤后加入F ITC标记的兔抗小鼠或羊
抗兔二抗于室温孵育30min, PBS洗涤后Hoechst
33258复染细胞核, Olympus荧光显微镜观察、计数
并拍照。
71RT2PCR检测:取5 ×106 诱导分化后的细胞,
以Trizol常规提取总RNA。逆转录反应为40μl体
系,含2μg 总RNA、25μg/ml的随机引物、015mM
dNTP、115mM MgCl2、10mM DTT、1 ×buffer 和
2μlRNA酶抑制剂和2μlM2MLV。PCR反应条件为
NSE ( 94℃, 30 s; 53℃, 30 s; 72℃, 30 s ) 、GFAP
(94℃, 30 s; 57℃, 45 s; 72℃, 45 s) 、MBP (94℃, 30 s;
52℃, 45 s; 72℃, 45 s) 。引物序列分别为: NSE
(101bp)上游5′2 TTACTTAGGCAAAGGTGTCCTGAA2
3′,下游5′2 GCTTCTCTTGCTCCA CCACAG23′; GFAP
(244bp)上游5′2 TGCTCAATGTCAAGCTGGCC23′,下
游5′2 CACATCACATCCTTGTGCTC23′;MBP ( 379bp )
上游5′2 TTAGCTGAATTC GCGTGTGG23′; 下游
5′2 GAGGAAGTGAATGAGCCGGTTA23′。以2%的琼
脂糖凝胶电泳,照相系统采集图片。
81细胞计数和统计学分析:以10个低倍镜视
野( ×10)下阳性细胞数( F ITC)计算阳性细胞百分
比,以€x ±s表示。
结果
11细胞形态:原代培养第3天,有散在的细胞
自组织块中游出(图1 A) ;培养5 - 7d后,大量细胞
由组织块中游出并贴壁,形态为长梭形(图1 B) 。
低密度接种时呈集落式生长,汇合后形成排列紧密、
旋涡状的汇合细胞(图1 C2F) 。
21细胞生物学特性: 细胞达80%汇合后, 以
012%的胰酶/EDTA消化并按1: 3的比例传代。消
化传代后,几个小时内迅速贴壁, 4 - 5d后细胞可再
次达到上述汇合程度(图1E) 。每次传代细胞数约
扩增3 倍。传至第23 代,细胞形态未发生明显变
化,增殖能力也无变化。细胞计数分析表明,细胞的
倍增时间约为30h。细胞周期分析表明, 8011 %的
细胞处于G0～G1期,仅一小部分细胞处于活跃的
增殖状态。
31细胞表型鉴定:流式细胞学检测表明, CD13、
CD29、CD44、CD90、CD105和CD166 等表面标志为
阳性表达,其余标志均为阴性(图2)
41神经分化:神经分化诱导后,部分细胞胞体
收缩成卵圆形或多角形,并出现初级及次级突起,形
态与神经元或神经胶质细胞相似。以NSE、MBP和
GFAP等神经标志物进行免疫荧光检测, 并计数
10个低倍镜下的阳性细胞数发现,第一神经分化方
案诱导后, 3 种标志物的表达分别为1211% ±
216%、918% ±111%和314% ±018%;以第二神经
分化方案诱导后, NSE 和MBP 阳性细胞分别为
8018% ±319%、412% ±113% ,但未能见到GFAP
阳性细胞(图3) 。未诱导的细胞未见MBP或GFAP
阳性细胞,NSE阳性细胞仅为111% ±014% ,且细
胞着色较淡。RT2PCR分析进一步在mRNA水平上
证实了未诱导和诱导的细胞神经标志物表达水平的
差异(图4) 。
讨论
中枢神经系统损伤后的修复与再生一直是神经
科学研究的热点。近年研究表明, 胚胎干细胞
( embryonic stem cells, ESCs) 、神经干细胞( neural
stem cells, NSCs) 和MSCs 均具有神经分化潜
能[ 2, 326 ] , 在移植于动物模型后可改善其神经功
能[ 7212 ] ,因此可作为某些神经系统疾病细胞移植替
代治疗的种子细胞。然而, ESCs尚存在定向分化和
纯化的技术障碍,且面临众多伦理、法律方面的问
题,也有移植后形成畸胎瘤的报道,应用受到一定限
制[ 2, 14 ] 。NSC也受到取材困难、不易获得及伦理、
法律方面问题的影响[ 3, 14 ] 。虽然骨髓MSCs也可改
善脑梗塞、脊髓损伤和外周神经损伤等动物模型的
神经功能[ 9213 ] ,但骨髓源性MSCs细胞有病毒感染的
危险,且随着年龄增长其干细胞数量和增殖能力也
显著下降[ 1 ] 。因此,寻找新的干细胞来源以更好地
应用于某些神经系统疾病的治疗具有重要意义。
前期工作中,我们曾成功诱导脐带血细胞向神
经细胞分化[ 15 ] ,并将人脐带血和骨髓MSCs用于脊
髓半切模型损伤大鼠的实验性治疗[ 16, 17 ] ,取得了令
人鼓舞的治疗效果。本研究中,我们则进一步探索
自人脐带的间质组织中分离MSCs的可靠方法及其
神经分化的有效方案: ⑴在分离方法上,骨髓、脾、
肝等组织或器官的MSCs分离中,通常需要胰酶或
胶原酶消化、流式细胞分选( FACS) 、磁柱细胞分选
(MACS)或反复贴壁等方法以去除其中混杂的造血
细胞和内皮细胞,因此需要时间较长,常会影响细胞
活力且增加细胞污染的机会。本研究中,我们则以
组织块培养法成功地分离出脐带MSCs。结果表明,
此方法不仅简便易行,可更好地保持细胞活力并减
少了污染机会。此外,在培养体系中,几乎见不到造
血、内皮或平滑肌等细胞的混杂。⑵细胞增殖分析
表明,脐带源MSCs的倍增时间约为30h,细胞周期
分析表明80%以上的细胞处于G0～G1期,流式细
胞学检测提示这些细胞表达CD13、CD29、CD44、
CD90、CD105和CD166等表面标志而不表达造血和
内皮细胞标志。但骨髓MSCs不仅含量低(仅占骨
髓单个核细胞的1 /104 ～1 /105 ) ,而且增殖力的变异
也很大,如部分可扩增达15代以上,而另一些却仅
能扩增4代左右。与之相比,脐带MSCs则含量丰
富、易于分离并且在传至23代时仍保持形态和增殖
力的稳定,表明这些MSCs具有良好的自我更新能
力,因此可在较短的时间内获得更多的细胞数量,以
满足临床需求; ⑶免疫荧光和RT - PCR表明,未经
诱导的MSCs不表达少突胶质细胞标志MBP和星
形胶质细胞标志GFAP,神经元标志NSE的阳性细
胞亦十分少见,且表达水平很低。但经神经分化诱
导,特别是在第二方案诱导后,大部分细胞发生明显
的形态改变,并开始表达神经元特异性标志NSE,这
不仅表明了脐带MSCs具有良好的可塑性,也使得
在较短时间内提供足够临床应用的神经元样细胞成
为可能,从而为临床应用奠定了基础。关于这一特
异性转化的机制是否与BHA的抗氧化作用和弗斯
扣林增加细胞内cAMP浓度形成的微环境更有利于
神经元方向的分化尚有待于证实。
总之,本研究证实了人脐带富含MSCs,且可在
体外进行分离、培养、扩增传代,在一定条件下可高
比率地分化为神经元样细胞。加之,脐带易于获得,
MSCs含量丰富, 脐带MSCs增殖能力好, 不表达
HLA2DR,无伦理和法律等方面的限制,在神经系统
疾病治疗和修复方面有着广阔应用前景。
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