| 【摘要】 目的 研究人脐血干细胞(HUCBCs)移植治疗脑缺血大鼠的疗效及HUCBCs在缺血大鼠脑内
的状况。方法 采集足月新生儿脐带血60～100 ml,分离出其中的单个核细胞,体外培养并予52溴脱氧嘧啶
尿苷(Brdu)标记48 h。采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型, 1 d后将3 ×106 HUCBCs经缺血侧侧脑室注
射入大鼠脑内。在移植后不同时间对大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS) ,用免疫组化技术观察移植后的
HUCBCs的存活、迁徙、分化状况。结果 HUCBCs在体外具有增殖能力;移植组大鼠自移植后3周起其NSS
显著低于对照组(均P 〈 0105) ;移植后2周、4周、6周脑组织切片中均可见Brdu染色阳性细胞,缺血侧明显多
于对侧(均P 〈 0105) ,移植后4周、6周明显多于移植后2周(均P 〈 0105) ;移植组各时间点脑组织切片中均
可见神经巢蛋白阳性细胞;植入的HUCBCs在大鼠脑内能向损伤区域迁徙并能分化为星形胶质细胞、少突胶
质细胞和神经元。结论 HUCBCs能在缺血大鼠脑内存活、迁徙和分化,并能改善其神经功能。HUCBCs移
植可作为脑梗死的有效治疗手段。
缺血性脑卒中现有治疗方法的疗效不够理想,脑
梗死患者的预后大多较差。脐血中富含造血干/祖细
胞,人脐血干细胞(HUCBCs)移植治疗神经系统疾病
的应用前景广阔。本实验主要探讨在大鼠脑缺血的
情况下经侧脑室注射移植HUCBCs治疗的可行性,以
及其对中枢神经系统缺血损伤修复的作用和可能的
机制。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 动物及分组 成年雄性SD大鼠(上海实验
动物中心提供) 36只,质量270～320 g,模型制作过
程中淘汰6 只。30 只脑缺血模型大鼠随机分为
HUCBCs移植组(15只)和缺血对照组(15只) 。
1. 1. 2 主要试剂与仪器 ( 1)试剂:人淋巴细胞分
离液(1. 077,天津产) ,人红细胞裂解液,细胞培养试
剂DMEM /F12 (1 ∶1, Gibco) , B27 添加剂( Gibco) , 52
溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu, Sigma) ,抗生素2抗真菌复合
物(青霉素、链霉素、两性霉素, Gibco) ;小鼠抗人巢蛋
白(Nestin)单抗(BD公司) ,小鼠抗人神经元特异性
烯醇化酶(NSE)抗体(Chemicon) ,小鼠抗人胶质纤维
酸性蛋白(GFAP)抗体(Chemicon) ,小鼠抗人2, 32环
核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体( Sigma) ,抗52溴脱
氧嘧啶尿苷(Brdu)单抗( Sigma) 。( 2)仪器:立体定
向仪,超净台,细胞培养箱,Olympus倒置显微镜XDS
218,密度梯度离心机, 10μl微量进样器。
1. 2 方法
1. 2. 1 人脐血单个核细胞(MNC)悬液制备 参照
Ha等[ 1 ]的方法采集足月新生儿脐带血60～100 ml,
分离脐血单个核细胞,以1 ×106 /ml的细胞密度接种
于含10 ml DMEM /F12的培养皿中,同时Brdu标记,
置于含5% CO2 的细胞培养箱中培养48 h后PBS反
复离心洗涤制备密度为3 ×106 /10μl的MNC悬液。
1. 2. 2 大鼠脑缺血再灌注(MCAO)模型制作 参照
Chen等[ 2 ]的方法,用直径013 mm的尼龙线插入大鼠
右侧颈内动脉,深度为20～22 mm,阻断右侧大脑中
动脉, 120 min后将尼龙线拔出。
1. 2. 3 HUCBCs缺血侧侧脑室移植 在模型制作成
功24 h后进行HUCBCs移植,将大鼠固定于立体定
向仪上,头顶部消毒后正中纵向切口,于前囟偏右旁
开114 mm,向后018 mm处在颅骨上钻一小孔,用10
μl微量进样器进针4 mm,注入3 ×106 /10μl的MNC
悬液,留针5 min后缓慢拔针,缝合切口。
1. 2. 4 神经损害严重程度评分(NSS) 参照Chen
等[ 3 ]的方法,分别于移植后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、
35 d、42 d对HUCBCs移植组及缺血对照组大鼠进行
NSS评分,主要观察其运动、感觉功能、平衡能力及生
理反射;总分为18分,正常为0分,分值越高其神经
损害越严重。
1. 2. 5 免疫组化检测 分别于HUCBCs移植后2
周、4周、6周随机处死HUCBCs移植组及缺血对照组
大鼠各5只。4%多聚甲醛500 ml经左心室灌注后,
断头取脑,置4%多聚甲醛后固定24 h,冠状位切取
以缺血区域为中心的包括侧脑室室管膜下区、基底节
区和海马的厚度2 mm的脑组织标本,石蜡包埋,连
续切片,片厚5 μm,进行Nestin、B rdu、NSE、GFAP、
CNPase免疫组化检测,观察移植后的HUCBCs的存
活、增殖、分化、迁徙情况。
1. 2. 6 统计学方法 数据以均数±标准差( €x ±s)表
示,组间两两比较采用t检验。
2 结 果
2. 1 HUCBCs的分裂能力 将体外培养2 d的HU2
CBCs置于倒置显微镜下,可见较多处于有丝分裂相
的细胞,分裂细胞占所有细胞比例10%左右。
2. 2 HUCBCs移植组与缺血对照组各时间点NSS的
比较 见表1。HUCBCs移植组在移植后1 d、7 d、14
d NSS 与缺血对照组比较差异无显著性(均P 〉
0105) ,但第21 d、28 d、35 d及42 d移植组NSS均明
显低于缺血对照组,差异有显著性(均P 〈 0105) 。
2. 3 HUCBCs移植组大鼠脑内免疫组化检测结果
Brdu染色: HUCBCs移植后2周、4周、6周大鼠脑组
织切片均可见B rdu染色阳性细胞分布,以缺血侧基
底节区、海马以及额顶叶皮质为密集,缺血侧Brdu阳
性细胞数明显多于对侧,差异有显著性( P 〈 0105) ;
移植后4周、6周大鼠B rdu染色阳性细胞数明显多
于移植后2周大鼠(均P 〈 0105) , 4周、6周之间比较
差异无显著性( P 〉 0105) 。见表2。各时间点大鼠脑
组织切片均可见Nestin染色阳性细胞,以缺血区域小
血管周围多见。移植后2 周大鼠脑组织切片中
GFAP、CNPase及NSE均呈弱阳性,移植后4 周和6
周可见GFAP染色阳性的星形胶质细胞,数量较多分
布于缺血区域,周边可见少部分CNPase染色阳性的
少突胶质细胞,NSE染色阳性的神经元数量最少,分
布于缺血区域周围。
3 讨 论
缺血性脑卒中现有的溶栓、抗凝等治疗手段仍存
在很大的局限性,不能根本改善脑梗死的预后。最近
对人胚神经干细胞( hNSCs)的研究[ 4 ]为中枢神经系
统损伤的修复带来了希望,但因其不易获得且存在伦
理学问题,实用性受到极大限制。
脐血干细胞用于细胞替代治疗具有来源丰富、采
集方便、低免疫源性及操作简单的特点,且可通过静
脉注射移植。脐血中的免疫系统处于原始阶段,
Bhattacharga等[ 5 ]用174 U 的脐血全血输注治疗62
例恶性及非恶性血液病患者未发生免疫排斥反应。
脐血中不仅含有丰富的造血干细胞,而且还含有大量
的多潜能干细胞,可以向内皮、血管以及神经等组织
分化。Nestin是一种中间丝蛋白,被作为神经干细胞
的标志性抗原,而CD133是造血干细胞的特异性标
志蛋白, Ha 等[ 6 ] 用免疫组化法发现超过60%的
HUCBCs在表达CD133的同时亦有Nestin的表达,说
明HUCBCs可以向神经细胞方向分化。Ende等[ 7 ]对
脐血MNC移植治疗神经变性病进行了一系列研究,
结果表明只要静脉注入( 100～110) ×106 MNC就可
显著提高帕金森病( PD)小鼠生存率,疗效优于同种
骨髓干细胞移植( 5. 6 ×106 ) ; 可延长Alzheimer病
(AD)转基因小鼠[ 8 ] 、Huntington转基因小鼠[ 9 ]及肌
萎缩侧索硬化小鼠[ 10 ]的寿命。Chen等[ 2 ]则将人脐
血MNC静脉植入MCAO大鼠模型, 7 d后其神经功
能即明显改善, 免疫组化提示有神经细胞核抗原
( neuN)和GFAP的表达。国内有移植HUCBCs治疗
脊髓损伤大鼠取得满意疗效的报道[ 11 ] ,但尚未见有
HUCBCs治疗脑梗死方面的实验研究。
本实验用无菌塑料采血袋密闭式采血方法采集
并分离人脐血MNC,B rdu标记并培养, 2 d后发现大
约10%的MNC具有分裂能力;本研究采用与Chen
等[ 2 ]不同的移植途径,即经缺血侧侧脑室将HUCBCs
植入MCAO大鼠,旨在提高脑局部的植入细胞浓度;
3周后HUCBCs移植组NSS评分即显著低于缺血对
照组(均P 〈 0105) ,说明HUCBCs移植可改善脑缺血
大鼠的神经功能;移植后2周免疫组化检测到Brdu
阳性细胞迁徙到缺血区域边缘, 4周和6周时缺血区
域有大量该阳性细胞, 明显多于2 周时(均P 〈
0105) ,并分化为GFAP阳性的星形胶质细胞、CNPase
阳性的少突胶质细胞,NSE染色阳性的神经元数量最
少,分布于缺血区域周围。以上现象表明脐血干细胞
在大鼠脑内的迁徙和分化需要一定的时间,由此也可
解释HUCBCs移植组在移植后前2周神经功能与缺
血对照组相比无明显改善的原因。本实验过程中所
用的Nestin、GFAP、CNPase、NSE抗体具有高度特异
性,与大鼠脑组织无交叉反应, 由此推断, 植入的
HUCBCs在缺血区域微环境信号的诱导下确有向病
灶部位迁徙并多向分化的能力。同时也发现少量植
入细胞迁徙到对侧,推测其随脑脊液的流动到达对侧
室管膜下区后向周围脑组织迁徙。在整个实验过程
中未使用免疫抑制剂, HUCBCs移植组大鼠无1只发
生免疫排斥反应。本实验尚没有证据表明由
HUCBCs分化而来的神经细胞能与宿主脑组织整合
并参与神经环路的重建。Chen等[ 2 ]认为虽然移植后
7 d大鼠的神经功能即有显著改善,但脑缺血范围并
未明显缩小,猜测其作用机制可能主要是移植细胞所
分泌的营养因子的作用,因为在短时间内植入细胞不
可能整合到宿主脑组织中并建立恰当的突触联系。
植入的HUCBCs含有大量的造血集落形成细胞、血小
板生成素和白介素211,造血集落形成细胞可产生造
血因子集落刺激因子21,这些营养因子可促进大鼠缺
血局部神经祖细胞的增殖以及分化,抑制细胞凋亡,
降低急性缺血引起的神经损伤并能促进其功能恢复。
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