第一节 概述
中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱
。
一、指纹图谱的产生与发展
1．指纹图谱的产生与发展
1．指纹图谱的概念
指纹图谱是以各种光谱、波谱、色谱等技术为依托的又一种质量控制模式。
与传统质量控制模式的区别在于：指纹图谱是综合地看问题，强调化学图谱的“完整面貌”即整体性，反
映的质量信息是综合的。
中药指纹图谱的基本属性：整体性、模糊性。
中药指纹图谱分析强调的是“准确的辨认”而不是“精密的计算”；比较图谱强调的是“相似”而不是“
相同”。
综上所述，指纹图谱可以定义为“中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色
的的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。
2．指纹图谱的沿革及现状
（1）指纹图谱的沿革
（2）指纹图谱的研究现状
3．指纹图谱的分类及发展
（1）指纹图谱的分类
狭义的指纹图谱是指中药化学指纹图谱，即表达植物药代谢产物化学特征的指纹图谱。
广义的指纹图谱则可按应用对象、测定手段进行不同的分类。
①按应用对象分类
按应用对象来分类，可分为：中药材（原料药材）指纹图谱、中药原材料（包括饮片、配伍颗粒）指纹图
谱、中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱、中药制剂指纹图谱。
②按测定手段分类
按测定手段可分为
中药化学指纹图谱：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS、HPCE、HSCCC等。
中药生物指纹图谱：中药材DNA指纹图谱、中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱。
（2）指纹图谱的发展
①指纹图谱的发展阶段
初级阶段应是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。初级阶段研究重点主要是测定方法的建立、方法稳
定性和适用性考察、化学有效部分基础研究、图谱多指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制
参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。
研究的高级阶段，即指纹图谱特征和药效相关性研究及指纹图谱的生物等效性研究。
初级阶段和高级阶段没有截然的分界线。在初级阶段主要是能进行较全面的质量控制，所以研究应该深入
，具体实施时，则应相对简化，以利于实际推广需要。初级阶段积累的数据也能为高级阶段提供基础。达
到能体现化学和药效相关综合信息的指纹图谱必将加快中药现代化的进程，必定能为中药走向世界提供可
靠的质量保证。
②指纹图谱信息化和知识化
指纹图谱信息化包括数据的获取和数字化。主要过程为针对某类样品和要求，确定合适的获得指纹图谱的
分析方法，建立整个分析方法的各种操作条件，进行测试，以获得不同样品的指纹图谱，即数据的获取。
对所得指纹图谱进行分析，确定其数字特征。
指纹图谱知识化是指在指纹图谱获得信息化基础上，研究如何来利用这些信息。指纹图谱知识化包括信息
解读、比较和判断，化学信息和药效信息相关性研究和信息的利用，即从大量指纹图谱数据中得到有关规
律和知识。
③指纹图谱的发展前景
中药指纹图谱的发展趋势是建立体现谱效关系的指纹图谱，实现指纹图谱信息化和知识化，使中药安全、
有效和可控。
二、指纹图谱的意义与作用
中药指纹图谱的应用研究，对加强中药质量控制（GLP）、保证中药功效，实现中药生产管理规范（GMP）
、提高中药工业整体水平，实施中药材质量管理规范（GAP）、带动中药农业现代化，推进中药走向世界
，都具有非常重要的现实意义。
1． 采用指纹图谱质控技术是保证中药功效、实现中药现代化的必须。
2． 指纹图谱技术是当前带动中药工业现代化的关键技术。
3． 指纹图谱质量控制是牵动中药农业现代化的技术纽带。
4． 指纹图谱质控技术是实现中药走向世界的必备保证。
三、指纹图谱的要求与构建
1．指纹图谱的要求
中药指纹图谱应满足特征性、重要性和可操作性，才能满足指纹图谱的实用要求。
2．指纹图谱的构建方法
指纹图谱的构建方法有：TLC、GC、HPLC、CE、HSCCC、SFC、CD等。
3．指纹图谱的数据处理
（1）直观分析比较
（2）量化数据比较
（3）化学模式识别技术
（4）化学计量学方法
（5）计算机软件分析
4．指纹图谱的构建程序
构建指纹图谱的主要步骤：样品采集、方法建立、数据分析、样品评价和方法检验。
第二节 中药色谱指纹图谱方法学
一、 高效液相色谱
高效液相色谱具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，是中药指纹图谱研究广为应用的方法之一。
HPLC分离模式和保留机制
分离模式 主要保留机制
液－固吸附 吸附剂的表面吸附
键合相 溶质在两相间的分配或溶质与极性固定相间的吸附
离子交换 溶质离子与填料上的反电荷层之间的电荷相互作用
离子对 电中性离子对在两相中的分配
分子排阻 基于流体动力学体积的过滤作用
手性 溶质手性异构体与填料手性作用位间非对应异构体相互作用
亲和 溶质与固定化配体间生化专属结合
正相色谱法（NPC）：色谱系统由极性固定相合非极性流动相组成。
反相色谱法（RPC）：色谱系统由非极性固定相合极性流动相组成。
1．分离度与试验条件
（1）溶剂强度的影响
（2）选择性影响
①改变流动相
A． 溶剂强度对选择性的影响
B． 溶剂类型的选择性
C． 优化溶剂类型的选择性
D． 对酸性、碱性化合物的选择性
②改变固定相
③改变温度
（3）柱理论板数的影响
2．色谱柱
色谱柱是HPLC系统的心脏。稳定的、高性能的色谱柱是建立稳健的、重现的方法的根本。
（1）柱填料
HPLC多数柱填料是由硅胶颗粒制备的。以硅胶为基质键合有机表面层，如C18、C8等用的最多。
在HPLC中使用最多的有三种填料颗粒类型：全多孔颗粒、微表膜颗粒、灌流颗粒。
① 硅胶填料
优点：大多数硅胶机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床，在长期高压操作下不变形，反压较低、
柱寿命长。突出的优点是硅胶为基质的填充柱较其它材料制成的柱有更高的柱效。
缺点:高pH值下会溶解。有些硅胶的另一缺点是表面呈酸性，在分离碱性化合物时拖尾。
② 多孔聚合物
优点：可在pH1～13范围内使用。
缺点：与硅胶在÷基质填料色谱柱相比，多孔聚合物填充柱的缺陷时柱效较低。
③ 其他无机填料
包括石墨化炭、氧化铝合氧化锆等。
（2）键合固定相
①键合硅胶
②极性取代基硅烷键合相
③反相键合相的保留
④ 键合相柱的稳定性
⑤ 键合相填料的新进展
3．色谱峰的检测
（1）紫外监测器（UVD）
UV检测波长的选择应能够使样品中各个成分有较大的吸收，而对溶剂使“透明”的，即流动相对这一波长
的吸收值很低。如果流动相对检测波长有吸收，则到达检测器二极管（或光电管）的光强度将降低，基线
噪声增加，检测灵敏度下降。流动相对检测波长的吸收值应小于0.5。
（2）其他检测器
①折光检测器（RID）和蒸发光散射检测器(ELSD)
常称为通用检测器，它们几乎对所有样品成分均有响应，且对不同化合物的响应差别较小。因此，这些检
测器主要用于：A.样品缺乏UV响应；B.流动相强烈吸收检测波长；C.用色谱峰面积归一化法分析未知成分
的含量；中药指纹图谱分析中很少进行上述C。
②荧光检测器（FD）
FD具有选择性好、灵敏度高的特点，测定浓度在ng/ml范围或更低，因而是样本痕量组分测定的一种理想
检测器。
③电化学监测器（ECD）
可用ECD检测的化合物有：A可氧化化合物；B可还原化合物；
ECD具有与FD检测器同样的优点:高灵敏度及选择性。不足的是：要求使用高纯度溶剂；流动相具导电性；
对流速、温度、离子强度、pH等敏感；利用还原反应时，样品溶液和流动相中的氧会产生信号；电极表面
可能发生吸附、催化反应等，工作电极需经常清洗且寿命不长。
④质谱检测器(MSD)
MSD在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。主要缺点时
价格比较昂贵，对操作条件要求较高。
其他较少使用的检测器有：
① 化学反应，包括化学发光检测器（CL）
② 放射性检测器
③ 旋光检测器
④ 核磁共振检测器
5． 建立方法的步骤
为了建立一个HPLC方法，通常进行以下步骤：
① 了解样品的信息，分析的目的和要求；
② 供试品的制备；
③ 选择检测方法和条件；
④ 选择HPLC方法；
⑤ 优化分离条件；
⑥ 定性定量分析；
⑦ 分析方法验证。
建立方法之前，首先应了解样品的性质与组成，包括：
① 样品中的化学成分；
② 成分的结构或官能团；
③ 成分的分子量
④ 成分的酸碱性和pKa值；
⑤ 样品的适宜的溶剂及溶解度；
⑥ 成分的紫外吸收光谱。
（1） 供试品制备
① 溶剂萃取
② 固相萃取
③ 其他方法 如膜分离，超临界萃取，柱切换等。
（2） HPLC方法的选择与建立
6． 反相色谱法
（1） 反相色谱法－中性化合物
① 溶剂强度
② 溶剂的选择性
（2） 反相色谱法－酸、碱性及离子化合物
① 酸碱平衡与保留
② 化合物的pKa
③ 缓冲溶液的选择
④ 酸碱性样品RPC的优化
A． 起始条件：酸、碱性样品RPC方法的建立与中性样品有相似之处，可从中性样品分离的起始条件
开始。主要差别是流动相应缓冲，宜选用硅醇基影响最小的色谱柱；也可用pH范围宽的以硅胶为基质的柱
或聚合物柱等。
B． 控制选择性：
A） pH
B） 溶剂的强度（B％）
C） 溶剂的类型
D） 温度
E） 胺修饰剂
（3） 离子对色谱法
① 保留机制 反相离子对色谱的保留机制为样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水性的离
子对，而为RPC的固定相保留。
② 流动相pH
③ 离子对试剂浓度
④ 离子对试剂类型
⑤ 起始条件
⑥ 保留范围及选择性的控制
A.保留范围
B.选择性
C.其它影响选择性的因素
D.IPC的特殊问题
6．梯度洗脱
（1）概述
等度洗脱是在整个分离过程中，流动相的组成是恒定的，而在梯度洗脱中，流动相的组成在色谱运行过程
中是变化的。在梯度洗脱中，最常用的是二元溶剂系统（A和B），强溶剂B的浓度随运行过程增加。
二元线性梯度最为常用。在复杂的中药样品的分析中，梯度洗脱是必要的，也是最为常见的，例如：
① 样品的保留范围宽
② 样品分子量大
③ 样品中含强保留成分
④ 样品稀溶液的柱上浓集
同样，梯度洗脱也有缺点：
① 对设备要求较高，不同的仪器分离结果有差异。
② 基线随流动相组成的改变发生漂移
③ 某些检测器，如RID，不能用梯度洗脱。
④ 梯度洗脱要求色谱系统两相平衡速度快
（2）梯度洗脱原理
① 梯度陡度的影响
② 梯度范围的影响
③ 梯度形状的影响
同系物或寡聚物，通常分离度随分子量和保留的增加而下降。
色谱图有大量重叠峰区域或相反，色谱峰不多，但分离得很开的区域。
色谱图不同的区域需不同陡度的梯度以优化选择性。
（4） 梯度分离方法的建立
① 选择起始条件
② 调整梯度范围，以节省时间
③ 改变选择性α减少色谱峰重叠或过长的运行时间
④ 调整柱条件
（5） 梯度分离的试验条件
① 设备差异
A． 不同HPLC系统对分离的影响
B． 减少仪器VD的影响
C． 仪器VD和梯度性能测定
② 分离的重现性
A． 柱再生
B． 柱平衡
C． 不准确的梯度
③ 基线问题
A． 漂移
B． 非样品峰
7．正相色谱法（NPC）
NPC可用于分离中性和酸、碱及离子化合物，但是主要用于中性化合物的分离。
在HPLC方法建立时，应首先试用RPC，若初步试验证明样品不适合使用RPC分离，则改用NPC。NPC对下列样
品较适合：①样品不为RPC保留（强亲水性）；②样品为RPC强烈保留（强疏水性）；③RPC不能达到适当
的分离度（α≈1）；④样品含位置异构体、立体异构体或非对映异构体，NPC有较大的选择性（α）；⑤
样品溶于非极性溶剂，不溶于极性溶剂/水混合物；⑥样品在水溶液中会分解。
（1） NPC的保留机制
RPC的保留机制主要是分配过程，而NPC则为吸附过程。
① 样品和溶剂的定位
② 溶剂强度
③ 流动相选择性
④ 柱类型的影响
⑤ 温度影响
⑥ 用水溶液流动相分离亲水样品
（2）NPC的优化
①起始实验
A. 用腈基柱，己烷－丙醇作流动相
B. 检查色谱峰是否拖尾
C. 必要时调整选择性
D. 优化柱条件
②调整保留范围
③优化选择性
④ 其它问题
A． 缓慢柱平衡
B． 固定相含水量的变化
8．其它分离模式
（1）离子交换色谱法（IEC）
（2）分子排阻色谱法(SEC)
（3）手性HPLC
二、薄层色谱法
1．概述
薄层色谱在中药指纹图谱分析应用的特点
① 结果直观
② 离线操作的灵活性
2．薄层色谱的规范化
（1）器材的规范化
（2）操作规程的规范化
（3）供试品溶液的预处理
（4）展开溶剂的选择
（5）溶剂蒸气对色谱行为的影响
（6）环境因素的影响
三、气相色谱法
1．气相色谱法简介
气相色谱法按固定相状态分为气－固色谱法（GSC）和气－液色谱法（GLC）两类。GLC属于分配色谱，GSC
属于吸附色谱法。
气相色谱试利用样品中各组分在固定相（液）与载气两相中的分配系数不等而实现分离。具有分离效能高
、选择性好、灵敏度高、样品用量少、分析速度快及应用广等优点。
一些常用参数为（1）基线和噪音；（2）漂移
；（3）保留值；（4）相对保留值；（5）保留指数；（6）色谱峰区域宽度；（7）相平衡参数；（8）色
谱峰的峰高和峰面积。
各种气相色谱仪都包括六个甲苯单元，各单元功能为：
1) 气流系统：携带试样通过色谱柱，为柱内运行的试样提供驱动力；
2) 进样系统：引入试样，并使试样瞬间气化；
3) 柱系统：使柱内运行的试样得以适当的分离；是气相色谱仪的核心部分。
4) 检测系统：对已被分离的试样组分进行柱后检测；
5) 数据处理系统：记录并处理检测器输入的信号，输出试验结果（定性和定量）；
6) 温控系统：控制并显示气化室、色谱柱柱箱、检测器以及辅助部分的在线温度。
2．填充柱气相色谱
（1 ）气－液填充柱
①固定液涂渍
②色谱柱的填充
③色谱柱的老化
(2)气－固填充柱
①固定相
②色谱柱的填充与老化
3．毛细管柱气相色谱
（1）柱效
（2）分离数
（3）柱涂渍与柱惰性
（4）极性与吸附性
（5）热稳定性
4．检测器
气相色谱使用的检测器有：热导检测器、电子捕获检测器、火焰光度检测器、联用红外光谱检测器等，而
用于指纹图谱研究的主要是氢焰离子化检测器和联用质谱检测器。
5．分离条件的选择
（1）分离度的影响因素
（2）实验条件的选择
①色谱柱的选择
②柱温的选择
降低柱温的好处：A 分配系数比值增大，固定相的选择性增加；B 组分在流动相中的扩散系数降低，从而
降低了组分在流动相中的纵向扩散；C 减少固定液的流失，延长柱寿命和降低检测器的本底。
降低柱温的缺点：A 由于组分在固定液中的扩散系数减少，增大了传质阻抗，造成峰展宽；B 保留时间变
长，延长了分析时间。
程序升温色谱条件的选择：
A．升温方式
B．起始温度
C．升温速率
D．终止温度
③载气的选择
选择载气主要从三个方面考虑：对峰展宽、柱压降和检测器灵敏度的影响。
③ 气化温度与进样量
6．中药色谱指纹图谱定性与量化评价
对不同产地、不同采收期的中药材样品进行气相色谱指纹图谱研究，目的是从整体上定性中药材的品质。
四、毛细管电泳法
1．概述
（1）基本概念
毛细管电泳法 在毛细管中进行的电泳法，称为毛细管电泳法。毛细管电泳法（CE）又称高效毛细管电泳
法（HPCE）.
(2)电泳法的分类
①按支持体的形状 可分为平板电泳法与柱电泳法两类。
②按电泳柱的粗细 分为经典柱电泳法与毛细管电泳法。
④ 按分离模式 可分为毛细管区带电泳法、胶束电动毛细管色谱法等。
（3）毛细管电泳的流路
（4）毛细管电泳法的特点：具有柱效高、峰容量大、分析速度快、样品预处理方法简单及运行成本低等
优点。
（5）毛细管电泳法的应用
已成为生命科学研究、医学诊断、刑事侦查的重要手段。
2．毛细管区带电泳法
在毛细管中只填背景电解质溶液，组分靠电泳淌度的差别而进行分离的电泳法。
（1）基本原理
①电渗效应与电渗淌度
②表观淌度
(2)实验方法
3．胶束电动毛细管色谱
（1）分离机制
胶束电动毛细管色谱与CZE不同是在背景电解质缓冲液中加入离子型表面活性剂。当表面活性剂的浓度足
够大，达到或超过临界胶束浓度（CMC）时，则表面活性剂的单体就结合在一起，形成球状胶束。
（2） 表面活性
分为阴离子和阳离子表面活性剂两类。
4．环糊精电动毛细管色谱
环糊精是分离异构体最常用、最便宜的方法。改性CD选择性更好。
5．毛细管电泳法的进样技术
（1）电动进样
（2）气动进样
（3）进样的注意事项
①毛细管一旦插入样品溶液，应立即开始进样操作。
②电极和毛细管不能接触。
③只要监测器的灵敏度能提供足够的信号强度，进样区带越小越好。
④控制温度。
⑤ 样品溶液和缓冲液不尽相同。
⑥ 关于样品溶液和缓冲液的耗损和蒸发问题。
6．毛细管电泳的检测器
紫外监测器和荧光检测器是目前使用最广的两种检测手段。
第三节 中药色谱指纹图谱试验的规范化
一、中药指纹图谱的获取
1．样品的收集
2．供试品的制备
3．参照物的制备
4．指纹图谱试验研究
二、中药指纹图谱方法验证
1．专属性
2．准确度
3．精密度
4．范围
5．稳健性
三、中药指纹图谱试验操作规程
1．高效液相色谱指纹图谱试验操作规程
（1）供试品溶液的制备
（2）高效液相色谱试验条件
2．薄层色谱指纹图谱试验操作规程
（1）仪器与材料
（2）实验
3．气相色谱指纹图谱试验操作规程
（1）供试品溶液的制备
（2）参照物
（3）气相色谱试验条件
（4）系统适用性试验
（5）气相色谱指纹图谱的建立和辨认
4．毛细管电泳色谱试验操作规程
（1）供试品溶液的制备
（2）参照物
（3）实验仪器
（4）毛细管电泳试验条件
（5）系统适用性实验
（6）毛细管电泳指纹图谱的建立和辨
