脑缺血耐受(cerebral ischemic tolerance, CIT)由
Katagawa等[1]1990年在沙土鼠前脑缺血模型中发
现,对随后的缺血脑组织产生保护作用,虽然研究较
晚,但是保护作用明确,从而为人们对脑缺血防治的
认识,开辟了新的领域。本研究用Longa等[2]改良方
法制成局灶性脑缺血模型(MCAO),观察缺血预处理
对线粒体钙、细胞色素C(CytC)的影响,进一步探讨
缺血预处理(IP)发生机制。为缺血性脑血管疾病的
防治提供实验依据。
材 料 和 方 法
1 动物及分组
雄性Wistar大鼠24只,体重(260±30)g,由佳木
斯实验动物中心提供。动物随机分为3组:缺血预
处理组,在缺血再灌注前3 d行30 min的预缺血;模
型组,缺血2 h再灌注4 h;假手术组。
2 方法
2·1 局灶性脑缺血模型(MCAO) 大鼠术前禁食
12 h,禁水4 h。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻
醉,用烤灯维持直肠温度在37-37·5℃。颈正中切
口,暴露、剥离颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉,结扎
颈总动脉、颈外动脉,于颈总动脉下方剪一切口。将
预先制作前端钝圆的鱼线,置入颈内动脉(18·0±
0·5)mm,直至大脑前动脉近端,有轻微阻力感为止。
阻闭完成后鱼线抽出1 cm以恢复再灌注。
2·2 神经功能损伤评分 动物麻醉苏醒后,回笼,
自由饮食。采用Zealonga评分法,0分:无神经系统
功能缺失症状,活动正常者;1分:不能完全伸展对侧
前爪者;2分:爬行时出现向左转圈者;3分:行走时
身体向偏瘫侧倾倒者;4分:不能自发行走,意识丧失
者。评分为0分和4分者均被剔除。
2·3 脑线粒体的制备 动物用乙醚深麻醉,断头处
死,取出脑组织,冷生理盐水冲洗,滤纸擦干。每克
脑组织加入9 mL预冷的分离介质(0·1 mol/LTris-
HCl pH=7·4,1 mmol/LKCl,0·25 mol/L蔗糖)。用电
动玻璃匀浆机匀浆后,制成10%匀浆,低温离心(600
×g,4℃)15 min,取上清液低温离心(18 000×g/,
4℃)15 min,上清液为胞浆,留样品细胞色素C
(CytC)测定,沉淀加少量0·1 mol/L Tris-HCl pH=
7·4,1 mmol/LKCl制成线粒体悬液。用双缩脲法测
定线粒体蛋白含量,各管蛋白均稀释成0·2 g/L。
2·4 CytC的测定 采用改良的张均田[3]法测定。
标准曲线测定,取0·1 mmol/LCytC标准品(上海维思
化学试剂有限公司)0·2、0·4、0·6、0·8、1·0 mL加蒸馏
水至1·5 mL,再加几毫克磷二亚硫酸钠,520 nm测吸
光度(A)值,绘制标准曲线。样品吸光度(A)值根据
标准曲线计算其浓度。(胞浆直接测定,线粒体悬液
破膜后测定)。
2·5 线粒体钙测定 采用火焰原子吸收法。取线
粒体悬液1·5 mL,置于10 mL加盖刻度试管中,加入
浓硝酸5 mL,阴暗处消化1周。然后烘箱加热,使硝
酸尽量分解蒸发,加入1%氯化镧至10 mL,混匀,测
定吸光度值,由标准曲线计算浓度。
3 统计学处理
实验数据用均数±标准差(-x±s)表示,用方差
分析判断均数差异显著性。
结 果
1 神经功能缺陷评分
缺血2 h后再灌注4 h,进行神经功能缺陷评分。
预处理组与模型组神经功能缺陷评分为1分、2分、3
分,两者差异显著(P<0·05),见表1。
2 两组实验动物胞浆CytC、线粒体CytC和线粒体
钙含量
模型组胞浆CytC显著升高,线粒体CytC相应降
低。线粒体钙预处理组和假手术组均有显著差异
(P<0·05,P<0·01),假手术组与预处理组无显著差
异(P>0·05),见表2。
表1 各组神经功能评分的比较
Tab 1 Comparison of neurological scores in groups (-x±s. n=8)
Group Grade
Sham 0
Model 1.9±0.6
IP 1.3±0.5*
*P<0·05vsmodel group.
表2 各组胞浆Cyt C、线粒体Cyt C、线粒体钙的比较
Tab 2 Comparison of the contents of mitochondrial cytochrome C,
mitochondrial calcium and plasma cytochrome C after focal
ischemia for 2 h and reperfusion for 4 h (-x±s. n=8)
GroupPlasma Cyt C
(μmol/L)
Motochondrial
Cyt C(μmol/L)
Motochondrial Ca
(μmol/100 mg protein)
Sham 282.71±33.95 12.57±3.67 127.43±33.17
Model 346.19±37.72##8.82±1.82#76.53±17.58##
IP 286.39±27.59**12.08±2.60*112.38±20.03**
#P<0·05,##P<0·01vsshamoperation group;*P<0·05,**P<
0·01vsmodel group.
讨 论
IP是短暂缺血诱导出机体内源性保护机制,从
而加强缺血耐受的能力[4,5]。已有报道,实施预处理
30 min最易诱导缺血耐受,耐受产生于预处理后1 d,
持续5-7 d。其保护作用不仅表现在形态上,也表
现在功能上。脑IP的机制涉及基因的表达,新蛋白
的合成,还有一些损伤因子的作用,它们可在一定程
度、一定时间上表现出抗损伤作用。调控机制的阐
明对缺血缺氧性脑损伤的防治有重要意义。脑缺血
性损伤中,坏死与凋亡是脑细胞死亡的两种形式,两
者同时参与了脑损伤,而线粒体在调控细胞凋亡/死
亡中占有重要地位,是细胞死亡的调控中心之一。
本研究显示:脑缺血2 h,再灌注4 h,胞浆CytC
的浓度升高,而线粒体CytC浓度相应降低,这与Fu-
jimura等[6]报道相一致。迟发性脑细胞死亡及脑缺
血损伤边缘区,细胞的死亡形式以凋亡为主[7]。脑
缺血细胞凋亡的引发与线粒体CytC移位至胞质相对
应[8]。线粒体CytC可通过膜通透转运孔(permeabity
transition pore,PTP)开放所致的外膜破裂而释放,或
者通过较大的电压依赖性阴离子通道(VDAC)而释
放。CytC的再分布是caspase激活和DNA裂解的上
游事件。IP时热休克蛋白HSP70显著增高,其可抑
制CytC和dATP启动的凋亡蛋白酶活化因子(apopto-
sis protease activating factor,Apaf-1)与caspase-9复
合物的形成,可以有效阻抑细胞凋亡。IP时促进凋
亡和抑制凋亡基因均上调。Bcl-2可促进或抑制
VDAC的开放,从而调控CytC的释放和线粒体钙流
而影响细胞凋亡[9],Ca2+作为第二信使,其信号在胞
浆、内质网、胞核和线粒体间传递,引发生物学效应,
几乎参与一切调控细胞功能的信息转化过程,同时
也是细胞内代谢活动的重要元素,因此维持细胞浆、
细胞器、细胞核Ca2+浓度对生命活动是至关重要的。
已证实,IP时短暂细胞内钙升高,对后续的缺血产生
神经保护作用。较温和的细胞内钙升高易发生细胞
凋亡。胞浆内钙离子浓度的升高是细胞凋亡的重要
启动因素,其主要作用是能激活Ca2+/Mg2+依赖的
核酸内切酶,导致DNA于核小体间断裂,还能激活谷
氨酰胺转移酶、蛋白酶等引起凋亡相关基因的表达。
线粒体是细胞的钙储存库和调节器,线粒体内、外膜
之间的通透性转换孔(permeability transition pore,
PTP)、bcl-2形成的通道及线粒体膜上的转运体起
维持线粒体钙稳态的作用。PTP在调节基质内Ca2+
方面起重要作用。PTP呈低传导率开放,允许Ca2+
通过,调节线粒体钙稳态;当线粒体跨膜电位在各种
凋亡诱导因素的作用下降低时PTP开放,导致线粒
体膜通透性增大,使细胞凋亡启动因子如:细胞色素
C、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)、凋亡诱导因子(AIF)
等从线粒体释放出来。细胞色素C与Apaf相互作用
可激活caspase-9。许多使PTP开放的因素都要求
有Ca2+存在[10,11]。研究证实阻止线粒体膜通透性
的改变可防止细胞凋亡,因而阻止凋亡启动因子从
线粒体向外释放切断了细胞凋亡级联式反应中的关
键性环节,所以具有很强的抗细胞凋亡的作用。由此
我们认为,调节线粒体释放细胞色素C,维持线粒体
钙稳态是IP发挥脑保护作用的主要机制。阐明IP的
保护机制,为防治缺血性脑血管疾病提供理论依据
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