固相萃取理论
反相固相萃取
反相分离包括一个极性或中等极性的样品基质（流动相）和一个非极性的固定相。分析物通常是中等极性到非极性。几种SPE材料属于反相类，如烷基，或芳香基键合的硅胶（LC-18，ENVI-18，LC-8，ENVI-8，LC-4，和LC-Ph）。在这里，纯硅胶（一般孔径为60—40mm大小的颗粒）表面的亲水性硅醇基通过硅烷化学反应，被含有疏水性的烷基或芳香基取代了。
由于分析物中的碳氢键同硅胶表面官能团的吸附作用，使得极性溶液（例如，水）中的有机分析物能保留在这些SPE物质上。这种非极性-非极性吸附力通常称为范德华力或色散力。为了从反相SPE管或片上洗脱被吸附的化合物，一般采用非极性溶剂去破坏这种化合物被吸附到填充物质上的力。LC-18和LC-8是标准的单键合硅胶，而ENVI-18和ENVI-8则属于聚合键合类填料，具有很高的硅表面覆盖率和较高的碳含量。这类聚合键合类填料具有更强的抗酸碱性，因而更适合于环境应用，如从酸化的液体样品中富集有机化合物。所有使用过的键合硅胶相都有一定数量的未反应硅醇基，它将成为二级相互作用之源。在萃取或保留强极性分析物或污染物时，这种二级相互作用是非常有用的，但是对分析物的吸附也可能是不可逆。
以下物质也用于反相条件：ENVI-Carb（碳），ENVI-Chrom P(聚合类)和Hisep(聚合涂层的键合硅胶)。
含碳的吸附物质，如ENVI-Carb材料，是由石墨和无孔碳组成，它对极性和非极性样品中的极性和非极性有机化合物有较高的吸附能力。该碳表面是正六圆环的原子结构，每个碳原子在石墨层上相互联接。这种正六圆环结构对某些分子有很强的选择性，比如平面型芳香化合物或类正六圆环分子和可形成许多表面触点的烃链分子。分析物的保留取决于其结构（形状和大小），而不是其上官能团与吸附剂表面的相互作用。洗脱时，使用中等极性到非极性溶剂。与烷基键合硅胶相比，尤其是在键合硅胶不灵时，ENVI-Carb显示出特有的结构和选择性优势。
聚合类吸附物质，如ENVI-Chrom P是苯乙烯-二乙烯基苯物质，用之保留一些含有亲水性官能团的疏水性化合物，尤其是芳香型化合物。有时在反相条件下，苯酚很难保留在C18键合硅胶上，这主要是因为它在水中的溶解度大于有机相。而ENVI-ChromP在反相条件下可很好地保留苯酚。洗脱时，使用中等极性到非极性溶剂，这是因为，聚合类填料对所有的溶剂都是很稳定的。
Hisep是一个疏水基（类似C18）键合硅胶涂上一层亲水聚合物，常用于反相条件，这种有孔的聚合物能阻止不需要的大分子被吸附到硅胶表面。聚合物的孔径大小只充许所分析的疏水性有机小分子化合物（如药物）接近硅胶表面，而不需要的大分子（如蛋白质）则被聚合物层隔离在外，没有机会接近硅胶表面，并被冲洗出固相萃取管。Hisep固相萃取过程类似于LC-18固相萃取过程。
正相固相萃取
正相固相萃取包括了一个极性分析物质、中等极性到非极性的物质（如丙酮，卤化溶剂和正己烷）和二个极性固定相。极性官能团键合硅胶（如LC-CN，LC-NH2和LC-Diol）和极性吸附物质（如LC-Si,LC-Florisil,ENVL-Florisil和LC-Alumina）常用于正相条件。在正相条件下，分析物如何保留取决于分析物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用，具体包括氢键、p-p相互作用、偶极一偶极相互作用和偶极-诱导偶极相互作用及其它。因此，由以上几种机理所吸附的分析物，应用比样品本身更极性的溶剂去破坏其相互作用，这样分析物才随之而洗脱。
键合硅胶LC-CN、LC-NH2和LC-Diol，有一个带有极性官能团的较短烷基链键合在硅胶表面上。因为极性官能团的存在，这种硅胶相对于反相硅胶更具有亲水性。常用的正相硅胶，它能从非极性的样品中吸附极性化合物。这种固相萃取管已用于吸附和选择性洗脱结构很类似的化合物（如异构体）、复杂的混合物或者象药物和脂类化合物。为了利用它这种疏水性，它也可用于反相条件（如水溶液样品）。
LC-Si填料是一种没有衍生的硅胶，一般用来作所有键合硅胶的基体。这种硅胶极亲水，必须保持干燥，这就要求所分析的样品必需无水。硅胶用于从非极性物质中吸附化合物官能团的都是表面自由羟基。LC—Si从非极性物质中吸附极性化合物，然后用一种极性更强的有机溶剂洗脱。多数情况下，ＬC-Ｓi是作为一种吸附剂，当硅胶基体用于有机萃取时，分析物不停留在硅胶上，而不要的化合物则被吸附在硅胶上，随之扔掉。这种过程称为样品前处理。
ＬC-Florisil和ENVI-Florisil固相萃取是一个镁化硅胶，通常用在样品的有机萃取，用其进行有机样品的前处理。它是一种强极性物质，可以有效地从非极性物质中吸附极性化合物。ENVI-Florisil固相萃取是由聚四氟乙稀或者不锈钢滤片制作。这种对环境过程非常重要的结构祥述在美国环境保护组织的方法中。ENVI-Florisil己用气相色谱分析法测定其背境较小。
LC-Alumina固相萃取用于吸附和样品前处理的过程，Al2O3材料可为酸性（Al2O3-A， pH约为5）、碱性（Al2O3-B， pH约为8.5）或者中性（Al2O3-Ｎ pH，约为6.5）。Al2O3的活性水平随水加入的多少，从1级到５级而变化，装管时，Al2O3可在装管前预处理或者装管后再处理。
离子变换固相萃取
离子交换固相萃取适用于带有电荷的化合物（一般为水溶液，也有有机溶液）。阴离子（负电荷）化合物可用ＬC-SAX或ＬC-NH2键合硅胶管进行分离；阳离子（正电荷）化合物可用ＬC-SCX或ＬC-WCX键合硅胶管进行分离。基本原理是静电吸引，也就是化合物上的带电电荷基团与键合硅胶上的带电电荷基团之间的吸引。为了从水溶液中将化合物吸引到离子交换树脂上，样品的pH值一定要保证其分离物的官能团和键合硅胶上的官能团均带电荷。如果某种离子带有与分析物一样的电荷，它将会干扰分析物的吸附。当然这种情况也可能是罕见的。洗脱溶液一般是其pH值能中和分离物官能团上所带电荷，或者中和键合硅胶上官能团所带电荷。当官能团上的电荷被中和，静电吸引也就结束，分析物则随之洗脱。另外，洗脱溶液也可能是一种其离子强度很大或含有另一种离子能取代被吸附的化合物，这样被吸附的化合物也随之而洗脱。
阴离子交换
LC-SAX是一种脂肪族季铵类盐键合在硅胶上的物质，季铵盐是一种很强的碱，带有一个正电荷，能交换或吸附溶液中的阴离子，称之为阴离子交换（SAX）。季铵盐的pH值很高（>14），在水溶液中，所有的pH条件下,都能带上电荷。这样LC-SAX可分离很强的阴离子化合物（很低的pH值,<1）或弱阴离子化合物（中等的pH值,>2），只要样品在其pH条件下，分析物带有电荷即可。对于阴离子分析物（酸性），为使之带上电荷，其pH值必需大2个单位。大多数情况下，被分析物是强酸性的或弱酸性的。
因为化合物被吸附地如此之紧，只有在不要求其阴离子回收率时（化合物被分离，然后扔掉），才能用LC-SAX萃取强阴离子。弱阴离子则能用LC-SAX分离，因为它们能被另外一种阴离子所取代或者被一种酸性溶液所洗脱，该酸性溶液的pH值可中和被取代的阴离子（pH小２个单位）。如果要求强阴离子其回收率时，可选用LC-NH2。
LC-NH2固相萃取填料适用于正相分离，当用于水溶液时也做为一种弱阴离子交换树脂（WAX）。LC-NH2填料含有一个脂肪族季氨丙基，并键合在硅胶表面上。这种伯胺基的pH值大约为9.8。因为其用于阴离子交换，样品的pH值必需小于9.8至少２个单位，此pH还必需保证所分析的阴离子化合物带上电荷（比其pH值大２个单位）。LC-NH2也可适用于强阴离子或弱阴离子分离回收，这是因为硅胶表面的氨基能被中和强阴离子或弱阴离子（比其pH大２个单位），这样强阴离子或弱阴离子都能被洗脱。弱阴离子也能用一种溶液（pH比该阴离子的pH小２个单位）而洗脱，或者加入另外一种阴离子取而代之。
阳离子交换
LC-SCX填料含有一个脂肪族磺酸基，并键合在硅胶表面上。这种磺酸基有很强的酸性（pH值<１），它能吸附或者交换溶液的阳离子，称之为强阳离子交换（SCX）。在所有的pH条件下，这种键合官能团都能带有电荷，只要该pH能保证所分析化合物带有电荷，因此其能用于强阳离子（pH值＞14）或弱阳离子（pH值<12）化合物的分离。对于所分析的阳离子（碱性）化合物，样品的pH要比其pH值小２个单位，以保正其带电荷。多数情况下，所分析的化合物是强碱性的或弱碱性的。
当不要求强阳离子回收或者被洗脱时，LC-SCX固相萃取管可用于强阳离子的分离。弱阳离子则可以用LC-SCX分离和洗脱。洗脱时，用一种pH比其pH大2个单位的溶液（中和分析物的电荷），或者加入另外一种阳离子取而代之。如果要求强阳高子回收率，可选用LC-WCX。
LC-WCX固相萃取填料含有一个脂肪族羧酸基团，并键合在硅胶表面上。这种羧基是一种弱酸性阴离子，所以它可作为一种弱性阳离于交换（WCX）。LC-WCX上羧基的pH约为4.8。当pH比其pH大2个单位时，它保持带负电荷，能分离此pH下带电荷的阳离子。LC-WCX适用于强阳离子或弱阳离子分离和回收，因为硅胶表面的羧基能被中和（pH比其pH小２个单位），强阳离子或者弱阳离子则被洗脱。对于弱阳离子可用一种溶液（pH比阳离子pH大２个单位）中和而洗脱，或者加入另外一种阳离子取而代之。
在很多情况下，由离子交换固相萃取所吸附的分析物被洗脱在水溶液中。如果必需使用酸性溶液或者碱性溶液去洗脱固相萃取管上的分析物，同时分析物又必需以有机溶剂来分析，而有机溶剂又不溶于水，这时可根据情况，试用含有酸的甲醇（98%甲醇、2%浓盐酸）或者含有碱的甲醇（98%甲醇、2%氢氧化氨）来洗脱。由于甲醇很容易挥发，样品可再溶解在另一种溶剂里。如果需要一个很强（非极性）的溶剂从固相萃取填料上去洗脱所分析物，可加一些二卤甲烷、正己烷、乙酸乙脂到酸或碱性的甲醇里。
二级相互作用
以上详述了化合物在固相萃取方法中是如何保留的基本原理。对键合硅胶可能有二级相互作用的存在。
对反相键合硅胶，基本原理是非极性的相互作用。然而，由于硅胶只是主体，有一少部分硅甲醇存在，这就有一些极性二级相互作用（正如我们在正相固相萃取取所谈）将要发生。如果非极性溶剂不能有效地从反相固相萃取填料上洗脱化合物，就有必要加些极性溶剂（如甲醇），以破坏极性相互作用而保留的化合物。在这种情况下，甲醇与硅胶上的羟基形成氢键， 打断了分析物与硅胶上的羟基形成的氢键。
硅甲醇在硅胶表面，Si-OH，也可为酸性，当pH大于4时，以Si-O-型式存在。这时在硅胶基体上也可能发生阳离子交换的二级相互作用，能吸附阳离子或碱性分析物。在这些情况，调整洗脱溶液的pH非常重要，以破坏这些相互作用而洗脱分析物（酸中和硅甲醇或碱中和分析物）。可选用含有酸的甲醇（98%甲醇、2%浓盐酸）或者含有碱的甲醇（98%甲醇、2%浓氢氧化氨），或者用一种熔于甲醇的非极性有机溶剂来洗脱。
正相键合硅胶通过其键合基团展示了极性保留机理，但是也有一些二级相互作用发生在分析物与联接键合基团的烷基链之间。在这种情况下，更非极性的溶剂或极性—非极性混和溶剂可用来做洗脱溶剂。作为反相键合硅胶，硅胶基体与分析物之间的二级相互作用和阳离子交换作用也可能发生。
离子交换键合硅胶不仅能提供这种分析物与硅胶上部分非极性基团之间的非极性二级相互作用，而且还有分析物与硅胶基体之间的极性和阳离子交换作用。要从这些填料上洗脱分分析物，一个准确的pH、离子强度和有机物的含量是必要的。
固相萃取中的PH影响
用在固相萃取中的溶液有很大pH范围的溶液有。硅胶作为基体原料，如高压液相色谱柱，通常稳定的pH范围是2-7.5。当pH高于和低于这个范围，键合相就会水解和从硅胶上断链下来，或者硅胶本身就溶解了。然而，在固相萃取中，常常溶液只与吸附剂接触较短的时间。实际上固相萃取管都是一次性使用，允许任何pH溶液以达到最佳保留和洗脱效果。如果固相萃取管对pH极限的稳定性非常重要时，聚合或碳键合固相萃取材料均可选用，如ENVI-Chrom P或ENVI-Carb。这些材料在1-14pH范围内都是稳定的。
对于键合硅胶上反相固相萃取过程，如果希望保留分析物，预处理的溶液和样品（基本上或全部为水溶液）的pH应调至最适宜分析物保留。如果，分析物是酸或碱性的，通常情况下，使用的pH应该阻止化合物带电荷。中性化合物（无酸性和碱性基团）的保留，一般不受pH影响。相反，也能调节pH，使样品中不需要的化合物保留在固相萃取的填料上，而分析物则不被保留而流出。在适当的pH，分析物的再次亲水性和阳离子交换作用则能被利用。
吸附剂(如ENVI-Chrom P和ENVI-Carb)用于反相条件，则应选择pH，使分析物最大程度地保留在反相硅胶上。一般使用有机溶剂洗脱时，这一点上的pH无足轻重。令人吃惊的是，当溶液在中性pH条件下，苯酚可带电荷，它能更好的保留在ENVI-Chrom P上，而不是溶液在酸性pH，苯酚不带电荷的情况。这表明，相对键合硅胶吸附剂对某些化合物有不同的选择性。当使用这类填料时，应对样品和预处理溶液的pH范围有所研究。
对于键合硅胶或吸附剂上的正相固相萃取过程，pH一般是无关重要的。因为在这些过程中所用的溶剂一般为非极性有机溶剂，而不是水。
离子交换固相萃取是如何保留化合物，很大程度上取决于样品和预处理溶液的pH。为了保留化合物，样品的pH应保证分析物和硅胶表面的官能团带上相反的电荷。详见第四页。
固相萃取的五个步骤
固相萃取过程要求样品以溶液形式存在，没有干扰，而且有足够的浓度以被检测。固相萃取的发展过程分为五步：
第一步 选择萃取管
1.正相柱、反相柱、吸附柱：样品质量不超过填料质量的5%。
2.LC-SAX和LC-SCX柱：其吸附剂容量为0.2毫当量/克
（1毫当量=1毫摩尔的[+1]或[-1]带电荷物质）。
3.LC-NH2和LC-WCX柱：离子交换容量由应用决定。
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样品基质是水溶液 |
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带电荷 |
弱阴离子和酸性：LC-SAX或LC-NH2
强阴离子和酸性：要回收LC-NH2，无回收LC-SAX |
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弱阳离子和碱性：LC-SCX或LC-WCX
强阳离子和碱性：要回收LC-WCX，无回收LC-SCX |
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中性 |
用LC-SAX、LC-SCX除干扰物 |
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样品基质是有机溶液 |
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带电荷 |
试用反相或离子交换萃取 |
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中 性 |
试用反相萃取 |
第二步 预处理萃取管
反相类型硅胶和非极性吸附剂介质，通常用水溶性有机溶剂，如
甲醇，预处理。甲醇湿润吸附剂表面和渗透键合烷基相，以允许更有
效地润湿硅胶表面。这些溶剂通常与洗脱剂一样是用于消除固相萃取
管上的杂质对分析物的干扰，
正相类型固相萃取硅胶和极性吸附剂介质通常用样品所在的有
机溶剂来预处理。
离子交换填料:对于非极性有机溶剂中的样品，用样品溶剂来预处
理。对极性溶剂中的样品，用水溶性有机溶剂来预处理。
为了使固相萃取填料从预处理到样品加入时都保持润湿，允许大
约1ml的预处理溶剂在管过滤片上。
第三步 加入样品
当过量体积的水溶液被萃取时，反相硅胶填料渐渐减少预处理时所
获得的溶剂化层。这就会降低萃取效率和样品的回收率。如果回收率较
低或重现性不好，可能是分析物流失。
为使适当的化合物保留在填料上，洗脱或沉淀不要化合物，要调节
pH、盐的浓度和样品溶液在有机相中的含量。为了避免堵塞固相萃取管
的过滤片，如果可能，在萃取之前预先过滤或离心样品。
流速会影响某些化台物的保留。一般来说，对于离子交换固相萃取
管，流速小应大于2ml／min；对于其它上的固相萃取管，流速不应大于
5ml／min；如果时间不是一个确定因素的话，滴速最佳。
第四步 冲洗填料
若分析物被保留在填料上，用一种不能洗脱所要化合物的溶液，去冲洗
掉不要的物质。冲洗液不超过一个管体积。
为消除不要的、可能保留很弱的物质，用比样品基质强，但其强度又不
至于洗脱分析物的的溶剂去冲洗填料。典型的溶液可含有比最后洗液少一点
的有机或无机盐，也可以调节不同的pH。与最后洗脱液完全不同极性的纯溶
剂或溶剂混合物可为有用的洗脱液（见表A）。
如果选用分析物不被保留在填料上的方案，则应用相当于一管体积的样品
溶剂去洗脱管上的分析物。在这种情况下，冲洗是作为洗脱来完成萃取过程。
第五步 洗脱感兴趣的化合物
用少量能洗脱分析物的溶液去冲洗填料（一般2ml-200 ml，取决于管的大小）
用两次少量液体洗脱分析物比用一次大体积更有效，当洗脱液停留在填
料上为20秒到1分钟时，分析物的回收率最好。这一步滴速是最有利的。
· 对于反相、正相和离子交换过程，一般五步全都需要进行；
· 对于样品净化过程，只需要前三步，并且在第三步，分析物将随着样品从
管内流出而收集，干扰杂质保留在吸附剂上。
表A 常用溶剂的性质
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正
己
烷 |
异
辛
烷 |
四
卤
化
碳 |
三
卤
甲
烷 |
二
卤
甲
烷 |
四
氢
呋
喃 |
乙
醚 |
乙
醚
乙
脂 |
丙
酮 |
乙
氰 |
异
丙
醇 |
甲
醇 |
水 |
醋
酸 |
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 非极性 极性
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样品的前处理
除了保证样品适当的pH值，您还应该考虑其它样品前处理的需要。以下部份描述了在使用固相萃取装置之前某些很难的样品应该怎样进行前处理。
血清、血浆、血液：血清和血浆样品不需要前处理即可用于固相萃取。然而，在很多情况下，分析物（如药物）可能结合在蛋白质上，它会降低固相萃取的回收率。为了破坏生物体液内蛋白质的键合，在反相或离子交换萃取过程中，可选用以下方法之一：
· 用0.1Ｍ或更大浓度碱或酸调节pH至极限值（pH<３或pH>９）。用上层溶液做样品进行固相萃取。
· 用极性溶剂如乙氰、甲醇或丙酮沉淀蛋自质（通常用两份溶剂/一份生物体液），混合均匀和离心之后，移取上层溶液，用水或缓冲溶液稀释即可用于固相萃取。
· 为沉淀蛋白质，用酸或无机盐如甲酸、高卤酸、三卤乙酸、硫酸氨、硫酸钠或硫酸锌来处理生物体液。在用于固相萃取之前，上层溶液的pＨ可能需要调节。
· 生物体液超声波处理15分钟，加入水和缓冲溶液，离心，上层溶液用于固相萃取。
尿：对于反相或离了交换固相萃苯取，尿样品不需要前处理，但样品加入前，经常需用水或有适当pH的缓冲溶液稀释。但某些情况下，酸水解（对碱性化合物）或碱水解（对酸性化合物）用来保证所分析的化合物在尿样品中自由溶剂化。通常将一个强酸（如浓盐酸）或碱（如10Ｍ氢氧化钾）加入尿中。加热尿样15-20分钟，然后冷却，用缓冲液稀释，调至适当的pH 即可用于固相萃取。也可用酶水解来释放被结合的化合物或药物。
细胞培养介质：细胞培养介质不用处理即刻使用。某些方法可能需要用水或有适当pH的缓冲溶液稀释其介质，以保证分析物在样品中自由溶剂化。如果细胞培养介质含有满载颗粒，是很难通过固相萃取装置。在用于固相萃取之前，它可能需要摇动和离心。大部分细胞培养介质的固相萃取使用反相和离子交换方法。
牛奶：一般牛奶使用反相和离子交换固相萃取条件。样品可能要用水和水/极性溶剂混合物（如甲醇，大约至50%）稀释。某些过程需要用酸处理来沉淀蛋白质（典型的盐酸、硫酸、三卤乙酸）。沉淀以后，样品要离心，上层溶液即用于固相萃取。
水样品：饮用水、地下水及污水只要不含大量固体颗粒，可直接用于同相萃取。地下水及污水在使用固相萃取之前可能需要过滤，如果所分析的化合物被结合在被遗弃的颗粒上，过滤会降低其回收率。如有可能尽量不过滤样品，让未过滤样品直接通过固相萃取装置，在洗脱过程中，让溶剂通过在吸附剂之上的颗粒，这将提高回收率。因为用这种方法，被结合在颗粒上的要分析化合物将得到回收。在很多情况下，水样品使用反相或离子交换固相萃取。
酒、啤酒、液体饮料:在反相或离了交换条件下，液体和酒精饮料不用处理就可用于固相萃取。对反相萃取，如酒精含量很高，需要用水或缓冲溶液稀释到酒精含量小于10%；如果有固体在样品之中，在用于固相萃取之前，有必要离心或过滤样品。
水果汁:水果汁一般不用前处理或离心既可用于固相萃取。如果离心，上层溶液用于固相萃取。粘性果汁可能需要用水或有适当pH的缓冲溶液来稀释。
药用液体样品:因为液体药品主要是水溶液，这类样品使用反相或离子交换固相萃取。如果样品具有粘性，必须用水或有适当的缓冲溶液来稀释。样品的有机萃取物可能要用正相固相萃取。
油类:碳氢或脂肪油通常是在正相萃取条件下分析的，因为它们不能用水稀释。稀释溶剂常选用中等极性到非极性溶剂，如正己烷和卤化剂。稀释的样品通过正相键合硅胶或吸附剂，样品在通过时被收集。所分析的化合物通过而不被保留，杂质则被保留在吸附剂上。如果分析物被保留在填料之上，不断地用增加溶剂的极性或用极性稀释混合物冲洗固相萃取填料，直到分析物回收到某一流份之中。为收集水样品中的油，使用反相同相萃取。
