氧化应激与细胞凋亡关系的研究进展机体在有氧代谢过程中产生的活性氧族(reactive oxygenspecies, ROS)主要包括O-·2、·OH、H2O2、HOCl、NO、O3和单线态氧等,对大多数细胞都具有毒性作用。在正常情况下,机体内ROS的产生和ROS清除系统处于动态平衡状态。由于种种原因,导致ROS产生增多或/和机体清除ROS能力的下降,机体就会出现氧化应激(oxidative stress)。当机体处于氧化应激状态时,体内组织细胞ROS量相对升高,超过机体的清除能力,可导致机体组织脂质过氧化水平升高,引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常,对机体造成损害。氧化应激使机体处于易损状态,同时能增强致病因素的毒性作用,可导致基因突变[1],它不仅与多种疾病的发生发展有关,也与细胞凋亡存在着十分密切的关系[2]。细胞凋亡(apoptosis)是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程,是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡,故又称为程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。凋亡细胞具有典型的形态学改变,主要表现为细胞膜出现囊泡、细胞皱缩、核固缩、DNA有序片段化等。细胞凋亡是机体的一种生理机制,在维护机体内环境稳定方面发挥着极为重要的作用,但细胞凋亡过高或过低都会对机体产生不利的影响。
1 氧化应激与细胞凋亡的关系
氧分子作为氧化磷酸化的终末电子受体,在需氧代谢中占有重要地位,但这种对电子需求的同时也导致了各种活氧的形成,如O-·2、·OH及具有氢抽提能力的H2O2、HOCl等。ROS可启动一个链式反应,易与细胞膜上的各种不饱和脂肪酸及胆固醇反应,这种直接作用于细胞的氧化损伤能导致细胞凋亡。但生物体在进化的过程中具备有效的抗ROS防御体系,如超氧化物歧化(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及抗氧化物质(如维生素C、维生素E)等,因此,机体代谢耗氧的同时常伴有ROS的形成,细胞的功能状态取决于ROS与抗氧化能力的平衡。
1·1 外源性活性氧诱导细胞凋亡
1991年, Lennon等发现低浓度的H2O2(10~100μmol/L)可诱导HL-60细胞凋亡[3],当H2O2浓度继续增高时,便可导致大量的细胞坏死。随后有学者用5μmol/LH2O2作用于胸腺细胞,8h后发现35%的细胞发生凋亡,当H2O2浓度达到100μmol/L时,凋亡细胞达42%。高颖等用300μmol/LH2O2作用于人慢性髓细胞白血病细胞(K652细胞),发现细胞核固缩、核破裂,FCM-DNA检测在G0/G1峰前存在一低DNA含量“凋亡峰”,DNA电泳显示间隔180~200bp的梯形图谱[4]。最近,Ishisaka等在用H2O2(10~50μmol/L)诱导HL-60细胞凋亡的过程中观察到DNA断裂,并发现线粒体释放CytC和caspase-3被激活;当H2O2浓度达50μmol/L时,溶酶体明显不稳定。Ishisaka根据大量的研究报道及自己的研究成果提出,H2O2是一种细胞凋亡介质[5]。此外,氧化的低密度脂蛋白(Ox-LDL)能诱导淋巴细胞发生凋亡,脂质过氧化物15-过氧化二十碳四烯酸(15-HPETE)和13-过氧化十二碳二烯酸(13-HPODE)亦可诱导A3·01细胞发生凋亡。正常细胞内每天能产生约1×1011个ROS分子,这些ROS
主要来源于:(1)细胞进行有氧代谢时呼吸链产生的副产物,如O-·2、H2O2和·OH;(2)呼吸爆发的产物,如O-·2、NO、H2O2和
Cl-;(3)脂肪及其他大分子降解时的副产物,如H2O2;(4)细胞色素P450系统在发挥解毒作用时产生的ROS。研究发现,当细胞内ROS生成增加或/和抗ROS能力下降时,均可导致内源性ROS增多。有学者报道,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激TNF受体,可导致细胞内ROS水平迅速升高,诱导细胞凋亡,并且这种细胞凋亡能被硫氧还原蛋白或N-乙酰半胱氨酸(NAC)所抑制,同时细胞对TNF-α的敏感性与SOD水平的降低明显相关。王爱国等让大鼠自由摄取含150mg/L NaF的水10周后发现,大鼠体内GSH含量下降、ROS和LPO水平升高,肝细胞凋亡率显著增高,肝细胞凋亡与氧化应激之间存在明显的正相关[6]。Murakawa等从鲭鱼体内提
取并纯化一种凋亡诱导蛋白(apoptosis-inducing protein,AIP ),用AIP作用于哺乳类细胞后,发现细胞内H2O2水平显著升
高,并诱导细胞快速凋亡[7]。MG132(一种26S蛋白小体抑制剂)使HepG2细胞H2O2水平显著性升高和线粒体膜电位下
降,导致细胞凋亡,这种HepG2细胞凋亡能被抗氧化剂如NAC、GSH和CAT所阻断[8];白细胞介素-1(IL-1)可诱导心肌成纤维细胞iNOS表达,使NO含量升高而导致细胞凋亡[9]Woo等研究发现,As2O3可致人宫颈癌HeLa细胞凋亡[10],在细胞凋亡早期ROS(主要是H2O2)浓度升高和线粒体膜电位下降,随后出现caspase-3的激活和DNA断裂,同时发现NAC能完全抑制As2O3诱导的细胞凋亡,该细胞与CAT共同孵育也显著性抑制As2O3诱导的细胞凋亡。上述资料充分表明:内源性活性氧生成增多可导致细胞凋亡。
1·3 抗氧化应激作用可阻止细胞凋亡
氧化应激使植物表现出与人一样的细胞凋亡,而植物体内的各类抗氧化物质(如醌类、维生素C、维生素E、酶及多肽类等)能保护植物免受氧化应激诱导的凋亡。许多学者也证实抗氧化剂(如NAC、GSH和CAT等)具有抗凋亡作用[7,8,10]不少学者认为抗氧化物质是通过清除ROS的方式起到抗凋亡的作用,但Anuradha等研究发现,抗氧化物NAC和GSH能阻止NaF诱导的HL-60细胞凋亡,并认为NAC和GSH抗凋亡作用是通过维护线粒体跨膜压、阻止线粒体释放CytC和Bcl-2下调实现的[11]。Bcl-2是原癌基因bcl-2的表达产物,是首先被发现的哺乳类细胞凋亡的调控因子,它与死亡基因ced-9编码的Ced-9分子同源,而Ced-9与线粒体呼吸链细胞色素b560复合物Ⅱ相似,说明Ced-9可能具有氧化还原或调节ROS的功能,同时也提示Bcl-2具有调节ROS的作用。细胞内bcl-2表达增强可阻断ROS相关的细胞凋亡,而且Bcl-2能抑制ROS导致的细胞凋亡,但Bcl-2是以什么方式阻断ROS诱导的细胞凋亡目前尚无定论。有报道,在GSH耗竭的神经细胞,Bcl-2不仅可中和H2O2和阻止脂质过氧化物的形成,而且可抑制细胞坏死,据此有人认为Bcl-2通过抑制ROS的形成而阻止细胞凋亡;但另有研究显示,Bcl-2能抑制缺乏ROS的细胞凋亡,综合多方面资料来看,抑制ROS的形成并非Bcl-2抑制细胞凋亡的唯一途径。Steinman认为,Bcl-2本身不是一种抗氧化剂,而是作为一种氧化原对细胞产生氧化应激,诱导细胞内源性抗氧化能力的增强,如SOD、GSH-Px、CAT等酶活性升高,从而阻止细胞凋亡[12];不过也有人认为,Bcl-2主要是通过维护线粒体膜的跨膜压[10,11],阻抑线粒体释放死亡因子如CytC、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)、Pro-caspase-3, 6,7等而起到抗凋亡作用的。
2 氧化应激诱导细胞凋亡的分子机制
氧化应激诱导细胞凋亡的分子机制目前还不十分清楚,概括起来主要有以下四种认识。2·1 ROS活化NF-KB并诱导NF-KB表达核转录因子NF-KB(nuclear factor-Kappa B, NF-KB)在正常细胞中与其抑制蛋白(IKB)结合而处于失活状态,许多刺激因素如干扰素(IFN)、脂多糖(LPS)、IL-1、紫外线、病毒等都可诱导IKB磷酸化而使NF-KB活化。NF-KB的激活通常是由氧化刺激引起的,因为ROS可促进蛋白激酶C(PKC)的激活,活化的PKC磷酸化IKB,导致后者与NF-KB解离而使之活化。Lo-tharius等研究发现,氧化应激可活化对其敏感的核因子NF-KB[13]; Angkeow等认为,细胞外的氧化刺激可激活细胞膜上Rac1调控的NAD(P)H氧化酶[rac1-regulated NAD(P)H oxi-dase][14],后者促使细胞浆中ROS的水平增高[15],ROS可直接激活NF-KB,也可以通过氧化还原因子-1(redox factor-1, Ref-1)或其他途径间接使NF-KB活化,如通过调节IKB激酶的活性及影响NF-KB与IKB的亲和力的方式来调节NF-KB的活性。Angkeow等在研究中发现一个有趣的现象,Ref-1在细胞浆中抑制Rac1诱导的氧化应激和NF-KB的激活,但是它一旦进入细胞核后,可以提高NF-KB与DNA的结合能力,促进基因转录,表现出核内外的双向作用。NF-KB被激活后,转位进入细胞核内,与凋亡相关基因如c-myc等的NF-KB调控元件结合,促进基因转录,诱导细胞凋亡。高颖等用300μmol/LH2O2作用于K652细胞[4],发现大量细胞凋亡,LCSM(激光共聚焦扫描显微镜)显示凋亡细胞内NF-KB表达增多,提示NF-KB具有促凋亡作用。
2·2 线粒体介导的细胞凋亡
线粒体是重要的细胞器,其DNA(mtDNA)是裸露的,并与呼吸链和富含脂质的线粒体膜紧密相连,使其对氧化应激损害的敏感性较核DNA更高;加之催化mtDNA复制的DNA聚合酶不具备校读功能及mtDNA缺乏修复机制等原因,造成mtDNA的损伤积累效应,从而出现片段的丢失、修饰及插入突变,突变的mtDNA可编码结构和/或功能改变的蛋白质(其中一些参与电子传递),又进一步促进氧自由基的生成,造成恶性循环。Zamzami等的实验结果表明ROS的增加可直接或间接损伤线粒体膜,造成膜电位下降[16],一些学者的研究结果支持这一结论[4,17]。而线粒体膜电位的下降可导致膜的通透性增高,使线粒体膜间腔的CytC释放入胞浆[5,18,19],与凋亡激活因子-1 (apoptosis activating factor-1,Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小体(apoptosome),在ATP参与下,凋亡小体内的pro-caspase-9可自身激活,形成具有活性的caspase-9,后者进一步激活caspase-3,6,7等[11,20];活化的caspase可进一步导致线粒体膜破裂,致使线粒体进一步释放其他一些caspases及激活因子(如AIF、热休克白60/100( Hsp60/100)等)[21];caspase-3,6,7被激活后,可催化靶底物分裂,如分裂DNA片段化因子DFF40,后者进入核内使DNA有序片段化;分裂聚ADP核糖聚合[poly-(ADP-Ribose) polymerase,PARP]和复制因子C大亚基(large subunit of replication factor C,RFC140)引起DNA修复和复制障碍,导致细胞凋亡。
2·3 ROS损伤DNA,激活P53诱导细胞凋亡
不少学者认为ROS可直接损伤DNA[14,22],因为ROS的中间产物自由基可直接作用于核酸,引起碱基的修饰和DNA链断裂,导致聚ADP核酸转移酶的活化和P53的积累,从而导致细胞凋亡,Schmitt等的研究结果支持这一结论[23]。DNA断裂损伤可以激活DNA依赖性的蛋白激酶(DNA-PK)和ATM(ataxia telangiectasia mutated,突变后患运动失调性毛细血管扩张症的基因表达的蛋白分子,是一种丝、苏氨酸蛋白激酶),二种酶皆催化c-Abl(一种酪氨酸蛋白激酶)S465磷酸化激活,后者再结合P53加强其稳定性,这与Martin等的研究结果吻合[24],许多凋亡因子基因启动子都存在P53反应元件(P53 re-sponsive element, PRE),结合P53后被激活转录表达,如促使Fas、FasL、Apaf-1、DR5和Bax等表达增高,而对bcl-2基因则抑制其表达;同时,P53还促进内质网释放TNF-α和Fas,也能与DNA复制蛋白A(replication protein A, RPA)结合,阻止DNA复制,上述效应最终激活caspase-3,6,7,促进细胞凋亡。但P53也促进P21表达而导致G1期阻滞,为什么DNA受损的细胞向凋亡方向而不是向细胞周期阻滞方向发展呢? Seoane等的研究提供了一个合理的解释,转录因子Myc被DNA连接蛋白Miz-1招募到P21启动子上,阻止P53及其他活化因子对P21的激活[25],从而选择性地抑制了P53对P21的转录活化作用,抑制P21表达,促进细胞凋亡。也有人认为ROS激活P53,诱导FDXP基因(P53家族一个靶基因)表达FR(ferredoxin reduc-tase),使细胞对ROS介导的细胞凋亡更敏感[26]。
2·4 ROS激活SAPK通路,介导细胞凋亡丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)信号通路包括三个主要的蛋白磷酸化级联,即细胞外信号转导蛋白激酶(ERKs)、C-Jun N-末端激酶(JNKs)和P38-MAPKs,后两者可被多种应激原激活,故也称应激活化的蛋白激酶(SAPKs)。Ma等研究发现,ROS可激活P38通路[27];不少学者也证实了ROS可激活JNK。在静止细胞中,JNK与P38定位于细胞浆与细胞核,一旦被激活,细胞浆中JNK与P38转位到细胞核,磷酸化修饰转录因子ATF-2和EIK-1,促进相关基因转录、表达,同时JNK与P38还磷酸化激活MAPK激活蛋白激酶2与3(MAPKAPK2,3),进而对低分子量的热休克蛋白磷酸化,Hsp能易化激活caspase,导致细胞凋亡。Inoshita等研究显示,氧化应激导致JNK活化,后者磷酸化Mcl-1(Bcl-2家族成员之一)丝氨酸121和酪氨酸163,使Mcl-1失活,导致细胞抗凋亡能力下降,而转染未磷酸化的Mcl-1后,细胞抗凋亡能力得到增强,表明Mcl-1在抗细胞凋
亡中起重要作用[28]。
此外,Carmody等用ROS诱导视网膜细胞后,细胞出现了磷脂酰丝氨酸(PS)外露、DNA片段化、细胞皱缩及细胞膜出现
囊泡等典型的凋亡特征[17];同时用TUNEL法也检测到大量阳性细胞,但在整个细胞凋亡过程中,caspases均没有被激活,使用caspase抑制剂zVAD-fmk、DEVD-CHO、BD-fmk也没能阻止凋亡的发生,表明视网膜细胞的凋亡过程中存在一条不依赖
caspase的途径。Ishisaka等在研究H2O2致HL-60细胞凋亡的过程中也发现,当H2O2浓度在50μmol/L以上时,溶酶体在细胞凋亡过程中发挥一定的作用[7],认为存在一条溶酶体介导的细胞凋亡途径。氧化应激引起细胞凋亡是当今医学领域的一个研究热点,其分子机制研究才刚刚起步,尚有许多问题需要进一步探讨。
