[点击浏览该文件:线粒体DNA损伤和自由基.rar] 线粒体DNA (mitochondrical DNA,mtDNA)是惟
一存在细胞核以外的遗传物质,长度为16 569bp,编
码区共37个基因,编码22个tRNA基因,2个rRNA
基因,13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白质基
因,均为线粒体蛋白质合成所必需[1]。在核基因调
控下控制氧化磷酸化和ATP的合成及自我更新,维
持线粒体基本功能。研究表明线粒体DNA损伤主
要是由自由基造成的,核酸分子损伤后一般不降解
而被直接修复,未被修复的损伤DNA片段可积累下
来,造成进一步更大的损害,从而导致器官功能障
碍。大量研究发现mtDNA氧化损伤与肿瘤、线粒体
肌病、神经变性疾病和衰老密切相关。本文就这一
氧化损伤发生、发展及防御机制的研究情况综述如
下。
人体内自由基的90%来源于线粒体,而mtDNA
直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧
中,缺乏组蛋白及其他结合蛋白的保护,缺乏完善的
损伤修复系统,致使氧化损伤成为mtDNA突变的主
要原因,所以mtDNA比核DNA突变率高5~17
倍[2]。
1 自由基的产生
自由基(free radical)是具有一个不配对电子的
原子和原子团的总称。引起人体内氧自由基产生的
原因很多。一方面,由紫外线和射线的照射、臭氧、
大量体育运动、药物、酒精、吸烟等外来因素引发的
自由基称为“外源性自由基”;另一方面,在新陈代谢
过程中由人体内生化反应所产生的自由基称为“内
源性自由基”。本文重点讨论内源性自由基产生的
机制。
1·1 自由基产生的线粒体机制
1971 Loschen年首先发现线粒体呼吸链能产生氧自
由基,研究表明人体90%的自由基是由线粒体产生
的。生理状况下,有1%~2%的氧接受一个电子生
成O2,或再接受一个电子生成H2O2。线粒体呼吸链
可能通过“渗漏机制”产生氧自由基,复合物I、III是
电子漏(electron leak)产生的主要部位,“漏出”的电
子直接和氧结合形成超氧自由基[3]。
1·2 黄嘌呤氧化酶途径
缺血、休克等病理条件下黄嘌呤脱氢酶(xan-
thine dehydrogenase, XD)大量转变为黄嘌呤氧化酶
(xanthine ocidase, XO)。降解ATP依次为ADP、AMP
和次黄嘌呤,再转变为尿酸,反应中组织内O-2、OH·
等氧自由基大量增加。
1·3 花生四烯酸(AA)途径
缺血再灌注时,由于细胞内Ca2+超载,激活了
钙依赖的磷脂酶,引发花生四烯酸(AA)代谢。通过
环氧合酶和脂氧合酶的作用产生大量的OH·和
H2O2。
1·4 NO合成酶(NOS)途径
NO是活性氮的前体,在血管内皮细胞、血小板、
巨噬细胞和神经细胞等许多细胞中,由NO合成酶
催化合成。过量的NO与氧迅速反应生成HO-、
NO2、NO-3等。这些是强效氧化剂,能自由弥散通过
胞膜,抑制细胞线粒体呼吸,减少ATP生成,引起组
织损害。
另外炎症反应引起的中性粒细胞激活,杀灭病
原微生物同时可形成大量氧自由基;各种应激反应
导致儿茶酚胺增加,产生具有细胞毒性的氧自由基。
2 自由基引起mtDNA损伤的实质
自由基对DNA、蛋白质、脂质、糖类等生物分子
发生攻击的过程中,主要发生氢抽提反应、电子转移
反应、加成反应、终止反应及歧化反应等5种基本的
自由基反应。
2·1 羟自由基
攻击碱基时,主要是·OH加成于富含电子的
DNA双链,尤其在嘌呤N-7-C-8位点和嘧啶5、6-位
点上;攻击糖基时,脱氧核糖链上一核糖被提取氢,
导致链断裂,碱基逸失。这些碱基、糖基的改变最终
可导致mtDNA点突变、缺失和插入突变,其中以片
段缺失多见。
2·2 氮氧自由基ONOO-
氮氧自由基可与H2O2形成1O2,使DNA脱氨基
生成黄嘌呤、次黄嘌呤,形成A-T、G-C的碱基突变,
还可以增强线粒体氧化应激,及细胞对过氧化物介
导损伤的敏感性。
2·3 单线态氧
Cl-与H2O2反应生成OCl-,再与H2O2生成单
线态氧,氧化DNA的鸟嘌呤。
2·4 脂性自由基
据推测脂质过氧化过程中产生的LO·LOO·等
自由基可以发挥与羟自由基相似的DNA攻击作用。
在生理情况下由于细胞内存有超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶
(glrtathione peroxidase, GSH-PX)等抗氧化酶类可以
及时清除自由基,保护机体。在病理条件下,由于活
性氧产生的过多或抗氧化酶类活性下降,则可引发
以上所述链式过氧化反应损伤线粒体DNA,进而导
致各种线粒体DNA的损伤突变。
3 线粒体DNA损伤的生物学标记
自由基在攻击线粒体DNA的生化反应中,常常
在线粒体DNA双环结构中留下损伤的痕迹即损伤
的生物学标记。在对线粒体DNA损伤研究中,寻找
氧化损伤的生物标志物非常重要,例如反映mtDNA
链断裂、8羟基脱氧鸟嘌呤(8-OH dG)的测定;反映
DNA修复与代谢酶多态性指标谷胱甘肽硫转移酶
(GSTS)及乙酰化酶(NATS)等的测定;最近研究表
明, 5羟甲基尿嘧啶也可以作为人类氧化应激的生
物标志物。目前8-OH dG是最常用可靠的mtDNA
损伤的生物标志物[4]。
4 线粒体DNA损伤的修复机制
过去多数学者认为mtDNA缺乏修复机制。近
年来研究发现线粒体还是具有一定的DNA氧化损
伤修复能力,但是这种机制并不完善。修复效率不
如核DNA。
总之,线粒体中虽然存在某些DNA修复酶以防
止突变发生,但缺乏校正阅读功能且清除突变碱基
的能力较低,结果使突变率增高,大约是核基因突变
的10~17倍。
5 线粒体DNA损伤的种类
线粒体DNA病理损伤导致的mtDNA突变主要
分为以下3类:在编码序列或tRNA、rRNA基因中发
生点突变;mtDNA大段缺失,即丢失了一个以上的基
因,如编码序列、tRNA序列的缺失;线粒体DNA丢
失。
5·1 线粒体DNA点突变
5·1·1 编码蛋白基因的点突变是一种酶的生物缺
陷
Leber氏遗传性视神经病是mtDNA11778位点的
G-A突变,使ND4亚单位的精氨酸转变成为组氨
酸,导致复合体Ⅰ功能减退[5]。
5·1·2 tRNA的点突变
常见位于线粒体的tRNALeu(UUR)基因上3 243位
点的A突变成G,该突变可阻碍mtDNA编码的蛋白
合成,并可严重导致rRNA转录终止,常见于线粒体
神经肌肉性疾病,如线粒体肌病、线粒体性脑病、乳
酸中毒、中风样发作综合征(MELAS)[6]。
5·1·3 线粒体核糖体RNA基因的突变
线粒体rRNA基因的12 SrRNA基因上第1555
位A到G的突变,影响蛋白质的翻译,导致了母系
遗传的氨基甙类诱导的耳聋和家族性耳聋[7]。
5·2 缺失突变
缺失突变不仅见于线粒体疾病,还可见于正常
衰老组织。由于mtDNA特殊的结构特点,缺失可影
响细胞的能量代谢。据病理分类主要有2类缺失。
5·2·1 单个缺失
缺失的分子数量常占总mtDNA的20%~80%,
常见于慢性进行性外眼肌麻痹(COEP), Kearns Sayre
综合征(KSS)及Pearson’s综合征[8]。
5·2·2 多重缺失
常见于组织的正常衰老过程,如骨骼肌、心肌及
脑。通常有以下2种:①mtDNA4977缺失是正常衰
老组织中积累的最常见的缺失,缺失位点为8483bp
~13459bp,位于编码ATPase8和ND5基因之间。在
神经和肌肉组织中mtDNA4977缺失水平最高[9]。②
mtDNA7436缺失位点为8649bp~16084bp,编码复合体
Ⅰ的5个亚单位,复合体Ⅲ、Ⅳ、V的各一个亚单位,
也是常见的一种缺失。
5·3 线粒体DNA丢失
一些非致命性呼吸衰竭、肝功能衰竭、肾功能衰
竭以及乳酸酸中毒病人的组织细胞中常见线粒体
DNA丢失,造成线粒体形态学改变、细胞生长抑
制[10]。
6 线粒体DNA损伤的结果
由于线粒体呼吸链功能在细胞基本新陈代谢中
的重要作用,编码线粒体呼吸链复合物的mtDNA
生氧化损伤,突变mtDNA数量超过一定阈值,其
果必将导致DNA表达异常、细胞的能量危机。
6·1 由于mtDNA中各基因排列紧密,除mtD
NA的D环一小段区域外,其他序列无内含子,且部
分区域出现基因的重叠,因此,mtDNA的任何突变都
会累及基因组中的一个重要功能区域。研究表明线
粒体DNA损伤后呼吸链复合物I、IV活性显著下
降,氧化磷酸化功能受损,ATP合成减少。突变导致
构成线粒体的蛋白质或蛋白质运输机制及离子通
有缺陷,就会产生“代谢性疾病”[11]。
6·2 线粒体可启动细胞凋亡的发生,在凋亡级联
应的调节中发挥着十分重要的作用。病理条件下线
粒体生成大量自由基,线粒体DNA广泛突变,线
体电子传递中断、能量生成障碍均可诱发细胞凋亡
对线粒体脑、肌病的研究表明,mtDNA缺失>40%或
tRNA点突变>70%时可在肌纤维观察到凋亡。证
明线粒体DNA突变致呼吸链功能障碍可能是凋
发生的病理基础[12]。
6·3 缺失突变常使mtDNA片段游离于胞质中,
不被代谢,游离的mtDNA片段穿过核孔,稳定地
合到核基因组中,其过程与病毒DNA插入哺乳类
胞染色体DNA相似[13]。有研究已经在人胚胎、白细
胞、几种人细胞系的基因组DNA中检出mtDNA片
断,发现HelaTG细胞中c-myc原癌基因有编码细胞
色素c氧化酶亚单位III基因序列。这种插入常
起核基因的异常表达、癌基因活化和抑癌基因灭活
而诱发肿瘤[14]。如果这种插入激活了核基因的衰
老相关基因,会启动细胞的衰老进程。
7 针对线粒体DNA损伤的保护措施及治疗
由于对线粒体疾病的致病机制还缺乏完善的
解,现在还没有有效的针对性治疗措施。目前常
的一般治疗措施是增加膜稳定性,增加呼吸链酶
性,如辅酶Q10;自由基清除剂,如:VC、VE、谷胱甘
肽;中药治疗,如:五子衍宗丸。
7·2 特殊治疗
研究证实150多种疾病与mtDNA损伤、突变有
关。Sherratt等[15]认为线粒体病的治疗可以从3
方面进行代谢治疗、成肌细胞互补、基因治疗。
综上所述,线粒体DNA有其独特的结构和功
特点,在维持细胞能量代谢中起着重要作用。随着
对mtDNA研究的进展,人们发现mtDNA损伤与线
体脑病、肌病、代谢性疾病、糖尿病、衰老退行性疾
病、肿瘤等有着广泛的联系,是这些疾病的分子生物
学基础。从1988年首次发现mtDNA病理突变至
今,人们在这一领域的研究不足20年,对其确切机
制仍然了解不够,更缺乏安全有效的治疗手段。因
此针对线粒体DNA损伤的研究有着十分重要的意
义。对不同线粒体DNA病理突变致病的分子生物
学机制的研究及其针对性的预防和基因治疗措施将
是未来研究的主攻方向。
