| 单细胞凝胶电泳试验( SCGE) ,又称慧星试验(comet as2
say) ,是近年来发展起来的一种高效、快速、形象化、灵敏度很
高的检测哺乳动物细胞DNA 损伤的新技术[ 1～3 ] ,它突破了传
统短期测试在许多领域的局限性,而且该方法更适合于测定
DNA 单链断裂损伤,故在检测化学物质致突变性方面有其独
特之处。该试验方法的优点之一是可以检测体内各种组织器
官的DNA 损伤作用,包括过去很少开展的神经细胞的遗传损
伤研究。
进行体内慧星试验,其关键步骤之一是组织细胞的分离
制备工作即将器官组织分离成单个细胞的悬液。由于神经组
织细胞的分离较其它器官组织难度大,并且要求达到一定的
细胞存活率,因此,目前尚未见到以神经细胞为靶细胞方面的
报道。本文旨在通过胰蛋白酶法、化学分离法和EDTA + 酶法
进行神经细胞分离的比较研究,建立适合脑和神经组织慧星
试验的样品制备方法。
1 材料与方法
111 实验动物及处理
健康3 月龄SD 大鼠,由浙江省实验动物中心提供,每晚
17∶30将雌雄大鼠按3∶1合笼,次日早晨8∶30左右阴道涂片检查,
见精子者为已交配,定为妊娠第0 天。
112 神经元单细胞悬液的制备
孕鼠自然分娩后,选用8 d 龄仔鼠,取海马及皮层脑组织,
Hank′s 液冲洗,备用。
11211 胰蛋白酶法 将所取脑组织剪碎,加入一定量质量浓
度为0125 % 的胰蛋白酶,于37 ℃,叵温水浴中振荡20 min 进
行消化,用DMEM 培养基终止消化,110 目网筛过滤,滤液以
1 000 r/ min 离心5 min ,弃上清液,将沉淀再用DMEM 培养
基制成单细胞悬液。
11212 化学分离法 取脑组织,将其剪成5～10 mm3 的小
块,然后加入一定量的氯化钠- 甲醛溶液,1 h 后将其置于150
目不锈钢筛中,用注射器针芯轻轻挤压组织,使之穿过筛网,
将滤液以1 000 r/ min 离心5 min ,弃上清液,加入Hank′s 液
调制成单细胞悬液。
11213 EDTA + 酶法 将EDTA ( 0102 %) 和胰蛋白酶
(0120 %) 按1∶1 混合配制成消化液。剪碎脑组织,加入一定量
的消化液,轻轻摇动后再倒掉大部分消化液,再倒入新的消化
液,15 min 后,加入比例为1∶2 Hank′s 液和DMEM 培养基的混
合液,终止消化,110 目网筛过滤,然后将滤液转到离心管中,
1 000 rpm 离心5 min ,去除上清液,加DMEM 培养基收集细
胞悬液。
113 受试物和细胞染毒
以丝裂酶素C (MMC , 分析纯) 作为诱变剂, 使用前用
Hank′s 液配制。上述3 种方法所得到的神经元单细胞悬液,
均应调整细胞密度至2 ×106 个/ ml ,并分装于试管中,每管
3 ml ,对受试组每管加浓度为200μg/ ml 的MMC 40μl ,阴性
对照组每管加30μl Hank′s 液。混匀后置37 ℃ 水浴中染毒
115 h。然后离心去除上清液,加DMEM 培养基重悬细胞,用
于彗星试验,同时用苔盼蓝观察细胞存活率,并对3 种方法的
结果进行比较。
114 彗星试验
方法参考singh NP 和张遵真等的方法[ 4 ,5 ] ,略作改进。
11411 制片 将浓度为01625 % 的正常熔点琼脂糖110μl
浇注于经预冷的毛玻片上作为第一层,加盖玻片置4 ℃下5～
10 min ,凝固后,取下盖玻片,取011 ml 浓度为2 ×106/ ml 的
细胞悬液加入019 ml (37 ℃) 的浓度为01625 % 的低熔点琼
脂糖中,混匀后迅速取75μl 加入到第一层琼脂糖上,加盖玻
片,置4 ℃下固化。
11412 裂解 取下盖玻片,将载玻片置于新配制的细胞裂解
液(pH 10) 中,4 ℃下避光20～50 min。
11413 解旋 裂解完毕,取出载玻片,用磷酸缓冲液( PBS ,
pH7) 洗去过多的盐,再置于水平电泳槽中,加入新鲜配制的电
泳液,液面高于载玻片012 cm ,避光解旋30 min。
11414 电泳 调整电压为20 V ,电流180 mA ,电泳15 min ,
使带负电荷的DNA 断片离开主核向阳极迁移,形成彗星样拖
尾,其长度与DNA 损伤程度相关[ 6 ] 。
11415 染色 电泳完毕后,取出载玻片用Tris - HCl (pH715)
浸泡漂洗2 次以上,每片滴加30μl (2μg/ ml) 的溴化乙锭,盖
上盖玻片。
11416 结果观察 在荧光显微镜下观察结果,DNA 损伤以拖
尾率及迁移长度(拖尾长度) 为指标。
115 统计方法
分别用χ2 检验(对细胞存活率和拖尾率) 和t 检验(对
DNA 迁移长度) 进行显著性检验。
2 结果与讨论
211 不同分离法对细胞存活的影响
见表1 。
(下转第81 页)
62 中国卫生检验杂志2005年1月第15卷第1期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology ,Jan 2005 ;Vol 15 No 1
定结果较为满意。
216 检出限和精密度
用接近空白的标准进行10 次测定,根据公式CL = ( x0 +
ks0) / s 计算出铅的检出限为01030μg/ ml。精密度为单个样
品15 次测定求出的相对标准偏差。见表2 。
表2 分析线、内标线、检出限、精密度、分析含量范围
分析线
(nm)
内标线
(nm)
检出限
(μg/ ml)
RSD( %)
分析含量范围
(μg/ ml)
Pb28313 Ⅰ Bi29913 Ⅰ 01030 6110 0106～1210
[参考文献]
[ 1 ] 籍雪平,张瑛,刘满英1 分析试验室,2002 ,21 (6) :90 - 921
[2 ] 张燕燕,孙丹陵,文学明1 工业卫生与职业病,2003 ,29 (4) :247 -
2491
[ 3 ] 杨秀英1 光谱实验室,2003 ,20 (3) :361 - 3631
[ 4 ] 张源,罗文鸿,李慧1 光谱实验室,2001 ,18 (1) :53 - 561
(收稿日期:2004 - 08 - 02)
(上接第62 页)
表1 不同分离方法对细胞存活的影响
组别
细胞存活率( % , x ±s)
胰蛋白酶法化学分离法EDTA + 酶法
MMC 9011 ±6213
3
8918 ±5418
3 9516 ±6612
空白对照9317 ±6511 9219 ±5813 9615 ±6816
与EDTA + 酶法比较, 3 P < 0101
表1 显示胰蛋白酶法和化学分离法的细胞存活率结果较
为接近,但低于EDTA + 酶法的结果。其中MMC 组中胰蛋白
酶和化学分离法的结果与EDTA + 酶的结果比较均有显著性
差异。司徒镇强等[ 7 ] 认为化学分离法可能抑制细胞代谢,而
一定浓度的酶可以消化细胞膜上的某些成份,均可以加速细
胞死亡,降低存活率,与本实验结果是一致的。同时3 种方法
中MMC 组的结果均略低于空白对照组。
212 3 种分离法制备细胞的彗星试验结果比较
见表2 。
表2 3 种分离法的彗星试验结果
组别
检测细胞数
(个)
拖尾细胞数
(个)
拖尾率
( %)
DNA 迁移长度
(μm , x ±s)
胰蛋白酶法:
MMC 200 174 8710 # 6118 ±4315
3
空白对照200 21 1015 913 ±117
化学分离法:
MMC 200 177 8815 # 6716 ±4913
3
空白对照200 18 910 819 ±210
EDTA + 酶法:
MMC 200 151 4515 # 3915 ±3218
3
空白对照200 12 610 412 ±111
χ2 检验与同方法中的空白对照组比较, # P < 0101 ; t 检验与同方
法中的空白对照比较, 3 P < 0101
从表2 可以发现,胰蛋白酶法和化学分离法同时都增加
了MMC 组和空白对照组细胞的拖尾长度,表明这两种方法在
分离过程中,可能存在着对神经细胞产生遗传毒性的某些因
素,这在Sasaki 等[ 8 ] 的研究中己得到证实,Singh 等[ 4 ] 也发现
一定浓度的胰蛋白酶在消化细胞时会产生较多的DNA 断片。
而EDTA + 酶法中虽然也加有一定量的胰蛋白酶,但浓度相对
较低,而EDTA 作用较为缓和,对DNA 的损伤程度也较小,因
此,拖尾率和DNA 迁移长度都低于胰蛋白酶法和化学分离
法。
3 小结
对于神经组织细胞的分离,EDTA + 酶法较胰蛋白酶法和
化学分离法对DNA 的损伤更小,更适合彗星试验的条件要
求。
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