| 摘要: 细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自杀性死亡过程。通过对凋亡机制的深入研究,人们发现线粒体
在凋亡过程中发挥着重要作用。本文综述了凋亡过程中线粒体的形态及分布变化,凋亡相关因子TR3、Bcl22
蛋白家族、细胞色素C、凋亡诱导因子、神经节苷酯GD3 及Ca2 + 等调节线粒体功能从而产生凋亡效应,同时还
探讨了线粒体外膜渗透性增加的两种主要理论。
关键词: 线粒体; 凋亡; Bcl22 家族蛋白; PTP
线粒体是真核细胞的一种重要细胞器,
其基质通过三羧酸循环氧化生成NADH ,形
成跨膜质子梯度和P或跨膜电位,线粒体内膜
上的ATP 合成酶利用此能量梯度合成ATP。
故线粒体是细胞内“动力工厂”,能产生和储
存ATP ,为细胞及其自身代谢提供能量。
早在1951 年有学者发现正常脊椎动物
发育中的细胞死亡。此后又先后提出在形态
发生中的细胞死亡、细胞凋亡(apoptosis) 、程
序性细胞死亡( PCD) ,从而揭开了细胞死亡
生物学研究的新篇章。目前认为细胞凋亡是
PCD 的一种形式,同时还存在非凋亡的PCD。
细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自杀过
程,普遍存在于各种生物生命活动中。一方
面,凋亡作为一种生理过程,参与生物体正常
发育;另一方面,在癌症、自身免疫性疾病及
神经退行性变等发生过程中,凋亡可视为生
物体的一种病理变化。许多环境因素特别是
存在于环境中的化合物以及有害金属元素如
镉、铅等能导致人体多种细胞发生凋亡。最
近几年,随着分子机制的研究,发现了许多与
凋亡相关的基因。
早期认为凋亡仅由核基因控制, 直到
1994 年才发现无核细胞(成熟红细胞) 也会
发生凋亡,随后又发现将凋亡细胞中的线粒
体移到正常细胞中能使后者发生凋亡[1 ] 。线
粒体是细胞中核外唯一含DNA 的细胞器,这
一发现激发了许多学者研究线粒体与凋亡的
关系。Abramova 等[2 ] 利用H2O2 诱导仓鼠成
纤维细胞凋亡时发现,在凋亡早期阶段(5h
内) 仅能观察到线粒体DNA 降解,而细胞核
DNA 不发生变化。最近有学者发现凋亡是
由线粒体DNA 和核DNA 相互作用双重调
控,线粒体蛋白可以释放进入细胞核内,调节
凋亡相关基因表达,产生凋亡效应[3 ] 。这些
现象充分显示了线粒体在凋亡发生过程中发
挥着重要作用。本文仅探讨了凋亡过程中线
粒体形态及分布的变化,凋亡调节因子通过
调节线粒体功能产生凋亡效应,同时还探讨
了线粒体外膜渗透性增加的两种主要理论。
1 细胞凋亡过程中,线粒体形态学及分布变
化
最近研究表明,凋亡发生的最早事件为
线粒体形态及分布的变化,早于半胱氨酸2门
冬氨酸特异蛋白酶(caspase) 和核酶的激活。
形态变化表现为线粒体体积减小,基质密度
增加,称为线粒体固缩(pyknosis) ,且这种变
化可逆转。在去除了神经生长因子(NGF) 的
凋亡交感神经元中能观察到线粒体固缩现
象,若加入NGF 或caspase 抑制剂,可观察到
呈固缩态的线粒体恢复到正常状态。线粒体
的分布变化表现为线粒体向核周聚集(peri2
nuclear clustering) ,正常状态下,线粒体弥散
分布于整个胞浆内,凋亡时线粒体向核周聚
集。线粒体固缩及向核周重新分布的原因可
能与caspase 激活无关,与凋亡蛋白Bax 整合
入线粒体外膜有关,但其具体机制不清[4 ] 。
随着凋亡的进行,线粒体呈气球样肿胀,伴有
线粒体嵴数减少或消失,原因可能为线粒体
内膜面积大于外膜面积,在各种因素致线粒
体渗透性改变时,胞浆内水及某些离子(K+ )
进入线粒体内,内膜扩张但保持完整,外膜肿
胀而破裂,这有利于线粒体膜间腔(intermem2
brane space) 内的物质释放到胞浆内,这些物
质参与了凋亡的调控[5 ] 。
2 凋亡相关因子对线粒体的调节作用
线粒体膜间腔含有许多潜在有害蛋白,
如caspase 前体、caspase 激活剂细胞色素C
(Cyt2c) 、caspase 共激活子SmacPDiablo 、具有
裂解DNA 能力的凋亡诱导因子(AIF) 、HSP60
、HSP10、腺苷酸激酶(AK,512kDa) 及硫酸氧
化酶(104kDa) 等蛋白质。当线粒体渗透性发
生变化或外膜破裂,这些蛋白质将释放入胞
浆内,诱导凋亡。细胞凋亡信号转导途径较
为复杂,某些细胞在外界刺激作用下可经死
亡受体(DR) 介导直接快速激活上下游
caspase 发生凋亡,该途径至少在开始时未经
线粒体。而另一些细胞,外界刺激只能激活
有限的caspase ,尔后通过线粒体对凋亡信号
放大后才能发生凋亡。线粒体能够汇聚多种
凋亡信号,然后将这些信号进行放大,释放出
膜间腔内的凋亡蛋白调节物,最终导致细胞
凋亡[6 ] 。因此,线粒体在凋亡过程中起着放
大、综合、执行的作用。
211 核转录因子TR3 易位至线粒体促进凋
亡
TR3 又名Nur77 或NGFIB、N10 ,属于核激
素受体6 个亚家族之一,具有DNA 锌指结构
结合域,由于胞内缺乏TR3 内源性配体,故被
称为孤儿受体。它能以同源二聚体或与同族
其他蛋白(特别是92顺视黄酸受体RXR) 形
成异源二聚体,与Nur77PNGFIB 结合反应元
件(NBRE) 或视黄酸反应元件结合存在于细
胞核内。TR3 在胞浆内合成后以二聚体形式
进入胞核,但在外界刺激下,TR3 重新进入胞
浆作用于线粒体外膜,使线粒体外膜渗透性
增加,释放出Cyt2c 、AIF、caspase 前体等,发生
凋亡。对转基因鼠的研究发现, 氨基末端
151 位氨基酸缺失的TR3 显性负突变超表达
能通过凋亡机制抑制胸腺细胞(发育中的T
细胞) 的负性选择。DNA 损害、佛波酯、视黄
酸衍生物CD437 及Ca2 + 载体等均可诱导TR3
从胞核易位至线粒体。尽管TR3 作用于线粒
体外膜的位点不清,但至少可以说明某些具
有致凋亡信号的核转录因子能通过线粒体而
诱导凋亡[7 ,8 ] 。
212 Bcl22 家族蛋白作用于线粒体调节凋亡
至今,哺乳动物中已经鉴定出15 种Bcl2
2 家族蛋白。所有这些蛋白至少含有4 种
Bcl22 同源结构域(BH1～BH4) 中的一种,该
家族蛋白依靠这些基元(motifs) 形成同源或
异源二聚体。Bcl22 相关蛋白分为两类:一类
具有抗调亡功能,如Bcl22 和Bcl2XL ,它们至
少含有3 个BH 结构域;另一类具致凋亡作
用,如Bax、Bak (含有BH1 、BH2 、BH3 结构域,
与Bcl22 相似) 以及只含BH3 结构域的Bid、
Bad (BH3
2only proteins) 。Bcl22 家族蛋白的C
末端具有20 个氨基酸残基的疏水区域,该区
域能使Bcl22 家族蛋白与线粒体外膜作用,使
之锚定在线粒体膜上,然后通过控制Cyt2c 释
放而调控凋亡。
抗凋亡蛋白Bcl22 主要分布于线粒体外
膜、核膜及内质网膜上,具有稳定细胞器膜的
作用。许多细胞类型中,Bcl22 或Bcl2XL 的超
表达能阻止线粒体Cyt2c 的释放、caspase 激
活和细胞死亡[9 ] 。另外发现外源性Bcl22 必
需与线粒体作用才能阻止Cyt2c 的释放[10 ] 。
Bcl22 同时也能阻止Bax 诱导的细胞凋亡[11 ] 。
说明Bcl22PBcl2XL 可通过线粒体抑制凋亡的
发生。
在没有凋亡信号刺激下,Bax 过度表达
能促进线粒体Cyt2c 释放。将Bax 直接加入
分离的线粒体中也能促进Cyt2c 释放,这种作
用能被Bcl2XL 所阻遏,但caspase 抑制剂不能
阻止Bax 的Cyt2c 释放效应,却可以有效地抑
制Bax 的凋亡效应,说明caspase 抑制剂作用
于Cyc2c 释放的下游事件[12 ] 。Bax 结合线粒
体的过程可能为:Bax 从胞浆易位到线粒体,
其N 端和C 端相互作用,C 端构象发生变化,
整合入线粒体外膜,同时Bax 寡聚化,促线粒
体释放Cyt2c[13 ] 。可见Bax 的分布变化及寡
聚化在促凋亡中起着重要作用。
Bid、Bad、Bim 在凋亡过程中也易位到线
粒体,它们在此与Bcl22 家族其他蛋白结合并
调节其活性。它们易位的原因有两种:一是
翻译后修饰(去磷酸化) ; 二是被caspase 裂
解,如caspase8 裂解Bid ,其C 末端片段(tBid)
具有易位入线粒体能力,激活Bax 或Bax 样
蛋白,导致Cyt2c 的释放。另外,tBid 本身也
可直接促Cyt2c 释放且这种诱导能力强于
Bax。Bid 或tBid 也能协同诱导Bax 的促凋亡
作用,这种作用能被Bcl22PBcl2XL 阻断[14 ] 。
213 线粒体释放Cyt2c 促凋亡
Cyt2c 是线粒体电子传递链复合体Ⅲ的
一个组分,由核基因编码,在呼吸链中起传递
电子作用。它既是细胞生存的必需分子又是
细胞死亡的启动分子。当线粒体释放Cyt2c
进入胞浆后,与凋亡蛋白酶激活因子Apaf21
羧基端的WD 重复序列结合,在ATPPdATP 作
用下,使Apaf21 构象发生变化,激活caspase2
9 ,后者再活化凋亡效应酶caspase23 ,被活化
的caspase23 再作用于底物蛋白Lamin (核层
蛋白) 、DNA 破碎因子、多聚腺苷二磷酸核糖
聚合物酶(PARP) 、甾体激素反应元件结合蛋
白(CREB21、2) 等,最终导致细胞凋亡。若抑
制线粒体Cyt2c 释放到胞浆中,则能够抑制细
胞凋亡的发生,如Bcl22PBcl2XL 能抑制Cyt2c
释放而抑制凋亡,将Cyt2c 显微注射到胞内可
诱导细胞凋亡。这充分说明线粒体释放Cyt2
c 在细胞凋亡中发挥了重要作用。
214 线粒体释放AIF 诱导凋亡
AIF 是一种黄素蛋白,由核基因组编码,
前体AIF 分子量为67kDa ,成熟AIF 分子量为
57kDa ,N 端含线粒体定位信号,具蛋白酶活
性。它在线粒体内的分布与Cyt2c 一致,位于
线粒体膜间腔中,细胞凋亡发生时,AIF 从线
粒体易位进入胞核,使DNA 裂解成片段,同
时又可促使线粒体释放Cyt2c 、caspase29 ,降低
线粒体内膜跨膜电位( △Ψm) 。AIF 的这种
致凋亡作用不受caspase 抑制剂的影响[15 ] 。
可见AIF 是线粒体内又一个重要的细胞凋亡
相关蛋白。
215 神经节苷酯GD3 作用于线粒体产生凋
亡
神经节苷酯GD3 是鞘磷脂的一种代谢
产物,其主要代表物为神经酰胺(ceramide) 。
神经酰胺及其类似物可使线粒体氧呼吸链受
损,产生有毒活性氧(ROS) ,促AIF 释放,诱
导凋亡, 这种作用能被Bcl22 超表达所抑
制[16 ] 。De Maria 等[17 ] 研究发现Fas 鞘磷脂通
路中,神经节苷酯GD3 有一短暂积累现象,
进一步研究发现GD3 合成酶的超表达能诱
导凋亡。最近研究发现,神经节苷酯GD3 可
单独或与Bax 协同作用诱导分离线粒体中
Cyt2c 的释放,产生促凋亡效应[18 ] 。由此可
见,线粒体也在神经节苷酯诱导凋亡通路中
发挥作用。
216 线粒体释放Ca2 + 诱导凋亡
线粒体内Ca2 + 较丰富,当线粒体膜损伤
后,Ca2 + 可通过多种途径进入胞浆,启动凋亡
相关途径,如激活一氧化氮合酶(NOS) ;激活
Ca2 + 依赖酶(C 激酶PKC、中性蛋白酶、磷酸
酶、钙离子2钙调蛋白蛋白激酶Ca2 +PCaM 蛋
白激酶) ;激活核酸内切酶等导致DNA 降解,
诱导凋亡发生。
3 线粒体外膜渗透性增加的可能机制
在不同刺激作用下,线粒体膜间腔内的
物质如Cyt2c 、AIF、pro2caspase 等蛋白经外膜
进入胞浆,促进凋亡。线粒体释放这些蛋白
的精确机制是什么呢? 目前,有两种理论较
为流行[12 ] :一是线粒体外膜的非特异性破裂
理论;二是Cyt2c 转导通道形成理论。
311 线粒体外膜非特异性破裂理论
该理论认为凋亡过程中水和溶质进入线
粒体基质,由于线粒体内外膜结构上的差异,
基质膨胀致外膜破裂而内膜保持完整,线粒
体基质内的组分仍留在线粒体内,膜间腔内
的物质则通过裂口进入胞浆。
有两种模型支持该理论:线粒体渗透性
转换孔(PTP) 开放和关闭模型。PTP 位于线
粒体内外膜交界处,由线粒体部分蛋白和胞
质中蛋白联合构成。其具体构成成分还不清
楚,可能包括胞液蛋白:己糖激酶(HK) 、线粒
体外周蛋白:外周苯并二嗪受体(BPR) 和电
压依赖阴离子通道(VDAC) 、线粒体内膜蛋
白:腺嘌呤核苷酸转运体(ANT) 及线粒体基
质亲环蛋白(Cph1D) 等。PTP 关闭模型认为
PTP 关闭后,胞浆ADP 与线粒体ATP 不能进
行交换,抑制呼吸链中F1 F0
2ATP 酶活性,H+
质子不能进入基质,产生△Ψm 超极化,促进
线粒体基质渗透性膨胀。PTP 开放模型认为
凋亡过程中Ca2 + 、腺嘌呤核苷酸、磷酸盐、活
性氧、pH 值及Bax 等因素使PTP 开放,线粒
体内膜对小于115kDa 的分子渗透性突然增
加,胞浆和线粒体基质间的电位差( △Ψm) 消
失,并形成化学平衡,基质渗透性膨胀。
显然,这两种模型存在较大分歧。从目
前研究来看,支持PTP 开放模型的证据较多:
①各种有害刺激诱导凋亡过程中,能观察到
△Ψm消散; ②PTP 开放抑制剂(米醇菌酸或
环胞菌素A) 及PTP 开放促进剂(苍术苷) 的
应用能抑制或诱导凋亡形成; ③Bcl22 家族蛋
白能够调节PTP ,影响△Ψm 调节凋亡。Bcl2
2 能抑制PTP 开放而Bax 能促进△Ψm 消散,
基质膨胀,Cyt2c 释放。由此看来, PTP 开放
可能为膜间腔内物质释放的原因。
另外,许多研究结果对此模型提出质疑,
主要集中在PTP 的开放和Cyt2c 的释放是否
有直接关联。研究发现Cyt2c 释放可出现在
PTP 开放、△Ψm 耗散之前,另外用重组Bax、
Bid 处理分离线粒体能诱导Cyt2c 释放,但并
不产生△Ψm 耗散、基质膨胀及外膜破裂,在
完整细胞及分离的线粒体中PTP 抑制剂不能
抑制Bax 介导Cyt2c 的释放。还有一些实验
提示凋亡过程中PTP 开放是Cyt2c 释放的下
游事件,并非Cyt2c 释放的前提条件。看来,
线粒体释放Cyt2c 还存在其他机制。
312 Cyt2c 转导通道理论
该理论认为在线粒体外膜上Bcl22 家族
蛋白寡聚化构成了允许较大蛋白通过的巨型
通道(megapore) ,该通道的开放促使膜间腔内
蛋白的释放。其证据有: ①Bcl2XL 、Bid 与白
喉毒素及大肠杆菌素有相似的形成通道孔的
结构域; ②在人工合成脂囊和平面双脂层中,
Bcl2XL 、Bcl22、Bax 及tBid 能形成功能性的离
子通道。③Bax、Bak 能直接促使线粒体释放
Cyt2c 。支持该理论曾提出了3 种模型的通
道: ①仅由Bax 寡聚化形成; ②Bax 与VDAC
共同构成; ③脂质孔或蛋白脂复合物构成孔
道。
凋亡时,Cyt2c 转导通道开放允许膜间腔
内物质释放,但线粒体仍具有功能,产生能量
供凋亡需要。但体内Bcl22 家族蛋白形成转
导通道及该种通道内径是否能允许Cyt2c 及
其他蛋白通过尚无直接证据。由此看来,该
论理需要进一步探讨和完善。
细胞凋亡的信号转导途径较多,包括死
亡受体途径、线粒体途径、蛋白激酶途径、信
号转导子和转录激活子途径、Myc 蛋白途径、
端粒2P53 途径等,其中以死亡受体和线粒体
途径为主,且这些信号转导途径网络存在相
互对话(cross2talk) 。其最终作用是激活凋亡
效应酶caspase3 ,降解DNA 产生凋亡。有关
线粒体与凋亡关系的报道提出了细胞死亡中
亚细胞结构的重要性,本文仅探讨了线粒体
在凋亡中的作用,其中线粒体外膜对膜间腔
内蛋白的渗透性增加的确切机制仍未搞清,
若这些问题得到解决,将有助于凋亡机制的
阐明。
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