| 水稻白叶枯病菌( Xanthomonas oryzae pv1 oryzae) 可能的致病因子包括毒素、胞外水解酶和胞外多糖
等。水稻白叶枯病菌的毒素为有机酸类物质, 它能显著地抑制水稻幼苗、根和叶的生长, 在低浓度时能
引起水稻萎蔫和坏死, 也能引起烟草快速坏死, 是重要的致病因子[1 ,2 ] 。Zhang 等曾从甘蔗白纹病斑周
围的泛生菌( Pantoea dispersa ) 中克隆到降解甘蔗白纹病菌毒素albicidin 的基因AlbD , 表达产物与al2
bicidin 毒素作用后, 降低该毒素的致病作用[3 ] 。Anzai 等从烟草野火病菌中克隆到ttr 基因, 该基因编码
乙酰转移酶, 其解毒机理是将烟草野火病菌毒素(tabtoxin) 上的氨基乙酰化而使毒素失活[4 ] 。本文报道
了水稻白叶枯病菌解毒蛋白的提取、分离和纯化以及理化特性和解毒机制。1 材料与方法
111 供试材料
菌株为JXO Ⅲ (日本系统Ⅲ号小种) 及对应的Tn5 转座子诱变突变体XooM3105 , 其对水稻品种IR26
分别为亲和与不亲和反应。水稻品种为IR26 , 烟草品种是NC89。
112 毒素和解毒蛋白的提取
11211 毒素的提取 参照Sreeramulu 等[5 ]的方法
11212 解毒蛋白的提取 参照吴健胜[6 ]的蛋白提取方法并有所改进。将JXO Ⅲ和XooM3105 分别接种于
Watanabe 液体培养基中, 28 ℃振荡培养96 h , 离心取上清。上清液通过细菌滤器(0145μm) 抽滤, 滤液
用30 % , 40 % , 50 % , 60 % , 70 % , 80 %饱和度的(NH4 ) 2SO4 分步沉淀, 离心。沉淀物用1 mol ·L - 1
Tris2HCl (pH 810) 溶解, 透析48 h。透析袋内液即为解毒蛋白粗提物(CDP) , 冷冻真空抽干备用。
113 解毒蛋白生物活性测定
11311 烟草坏死反应 用毒素稀释液(280μg·mL - 1) 和毒素(280μg·mL - 1) 与解毒蛋白混合液分别注
射接种于烟草叶片, 解毒蛋白的质量浓度分别是5 , 10 , 20 , 30 , 40 , 60 和80μg·mL - 1 , 同时设不同浓
度的解毒蛋白和水为对照。在室温观察24 h 内烟草坏死反应是否发生。
11312 对水稻露白种子出苗影响的测定 用毒素稀释液(280μg·mL - 1) 、解毒蛋白稀释液(5 , 10 , 15 ,
20μg·mL - 1) 、毒素(280μg·mL - 1) 与解毒蛋白(5 , 10 , 15 , 20μg·mL - 1) 混合液浸泡水稻露白种子
24 h , 然后将种子移入有石英砂的试管中, 在28 ℃下光照培养。观察各处理的种子出苗情况。
114 解毒蛋白的纯化
11411 等电聚焦电泳(RPIE) 取CDP 5 mL 加入215 mL 两性电解质Amphorline (pH315～10 , Amashia)
于滚动式等电聚焦电泳仪(Bio2Rad) 内, 12 W恒功率聚焦5～6 h , 减压收集样品, 测定pH 值, 透析后
测定生物活性。
11412 离子交换层析 经RPIE 分离获得的活性组分, 加入终浓度为10 mmol·L - 1的KH2PO4 NaOH 缓冲
液(pH 610) , 并以上述缓冲液为平衡液, 进行Q2Sepharose1FF. 离子交换层析(FPLC Phamacia) , 平衡
液加2 mol·L - 1NaCl 为洗脱液。收集洗脱峰, 脱盐后测定生物活性。
115 解毒蛋白的SDS PAGE电泳
将活性峰按Laemmili[7 ]的方法进行SDS2PAGE 电泳, 分离胶浓度为1215 % , 200 V 恒压电泳6 h。
116 解毒蛋白的理化特性测定
11611 蛋白酶K的稳定性测定 在2 mL 解毒蛋白稀释液(10μg·mL - 1) 中加入20μL 100μg·mL - 1的蛋
白酶K, 于37 ℃保温1 h , 然后与毒素(280μg·mL - 1) 混合, 浸泡水稻露白种子24 h。将种子移入铺有
石英砂的试管中, 28 ℃光照培养, 观察出苗情况。
11612 热稳定性测定 取解毒蛋白稀释液于沸水浴中加热5 min , 冷却后按11611 法与毒素混合处理水
稻种子。
117 解毒蛋白作用机理
11711 解毒蛋白脱羧活性测定 按文献[8 ] 的方法测定解毒蛋白对毒素的脱羧活性。
11712 水稻叶片苯丙氨酸裂解酶(PAL) 活性测定 将JXO Ⅲ菌株培养至对数生长期, 离心收集菌体。
称10 mg 湿菌体用灭菌水稀释至2 mL , 加入JXO Ⅲ解毒蛋白, 使其终质量浓度为10μg·mL - 1 , 剪叶接种
IR26 , 设JXO Ⅲ菌体、解毒蛋白和水为对照; 解毒蛋白稀释液(10μg·mL - 1) 均匀喷洒于IR26 水稻叶片
表面后, 用剪叶接种法接种JXO Ⅲ。水稻叶片按不同处理时间(0 , 24 , 48 , 72 , 96 h) 取样, 每样品约
1 g , 置- 70 ℃冰箱待测。PAL 酶活性测定参照文献[8 ] , 以OD 值增加0101 为一个酶活性单位(U) 。
11713 水稻叶片过氧化物酶(PO) 活性测定 按11712 方法处理水稻和取样, PO 酶活性测定参照文献
[8 ] 。以OD 值增加0101 为一个酶活性单位(U) 。
118 解毒蛋白田间防效测定
按11712 方法处理水稻, 两周后观察田间病害发生情况, 测量叶片病斑长度。2 结果与分析
211 水稻白叶枯病菌解毒蛋白的提取
21111 CDP 对毒素的解毒作用 用经40 %～50 %饱和度硫酸铵沉淀获得的CDP 与毒素混合处理水稻露
白种子, 当CDP 为10μg·mL - 1时, 能消除水稻白叶枯病菌毒素抑制种子出苗的作用(图1) ; CDP 为5 ,
10 , 20μg·mL - 1时, 有部分减轻烟草坏死的作用; 在30μg·mL - 1时, 基本消除由毒素引起的烟草坏死;
高于30μg·mL - 1时, 毒素的坏死作用完全消除(21112 解毒蛋白的精细纯化 CDP 经滚动式等电
聚焦电泳和离子交换层析分离, 收集pH 710～810
的第2 峰(图3) , 经生物测定为解毒活性组分
(图4) , 再经SDS2PAGE 电泳, 考马斯亮蓝染色,
有一条明显的主带, 其蛋白相对分子质量约为
4719 ×103 (图5) 。
212 解毒蛋白的理化特性
测定结果表明: 解毒蛋白对热和蛋白酶K 均
不稳定, 热处理5 min 和蛋白酶K处理1 h 均会使
其对毒素的解毒作用消失。
213 解毒蛋白的脱羧活性
水稻白叶枯病菌毒素是有机酸, 用解毒蛋白检测其对毒素的脱羧活性。结果表明: 解毒蛋白对毒
素的解毒作用是通过其脱羧酶活性起作用, 并且无毒突变体XooM3105 解毒蛋白对毒素脱羧活性明显高于野生菌JXO Ⅲ (图6) 。XooM3105 解毒蛋白引起的
最大反应速度Vmax (以CO2 计) 为1176μg·h - 1 , Km 为215 ×10 - 4 mol·L - 1 ; JXO Ⅲ的Vmax约为0196μg·
h - 1 , Km 为310 ×10 - 4 mol·L - 1 。
214 解毒蛋白处理水稻后水稻体内抗病相关酶活性的变化
21411 解毒蛋白对IR26 体内PAL 活性的影响 由图7 (A) 可见, CDP 处理水稻叶片, PAL 活性在0 ,
24 , 48 h 明显上升, 且高于直接接种JXO Ⅲ和水对照, 48 h 后开始下降; 用JXO Ⅲ接种水稻, PAL 活性
逐渐下降, 48 h 降至最低, 以后虽有回升, 但仍处于原有水平; 而用CDP 和JXO Ⅲ混合接种, PAL 活性
在48 h 达到最大值, 以后开始下降, 但在0～96 h 整个过程中, 均高于对照; 先喷CDP 后接种JXO Ⅲ,21412 解毒蛋白对IR26 体内PO 活性的影响 如
图7 (B) 所示, 无论对照和处理, 在24 h 内, 水
稻体内的PO 活性均呈上升趋势, 随后各处理PO
活性表现明显不同, 接水的对照, PO 活性变化不
大; 用JXO Ⅲ接种的则出现下降, 72 h 降至最低
值; 而CDP、CDP 与JXO Ⅲ混合以及先喷雾CDP 再
接种JXO Ⅲ等处理, PO 活性都明显上升, 72 h 基
本达到最高峰。说明解毒蛋白亦可提高水稻体内
PO 活性, 但PO 活性的最高峰较PAL 出现晚。
215 解毒蛋白在田间防病效果的初步试验
如表1 , 将CDP 和JXO Ⅲ混合后再用剪叶法处
理水稻, 14 d 后, 对水稻白叶枯病斑的相对抑制效
果为86184 % , 至28 d , 抑制效果仍达72178 % , 由
此可见, 解毒蛋白对水稻白叶枯病具有明显的抑制
作用, 在田间防效显著。先喷CDP , 再用剪叶法接
种水稻白叶枯病菌JXO Ⅲ , 1 4 和2 8 d 的抑制效果分别为63159 %和42177 % , 较前者抑制效果差。这可能是由于混合接种后, 解毒蛋白与病菌直接接
触, 其解毒作用消除了病原菌产生的致病毒素, 病斑明显受到抑制; 先喷雾解毒蛋白, 再接种病菌, 则
减少了与病菌的接触面, 因此抑制效果较前者差。3 讨 论
Noda 等已证明水稻白叶枯病菌能产生有机酸毒素, 在致病过程中起重要作用[1 ] , 邵敏等也曾从水
稻白叶枯病菌(JXO Ⅲ) 中提取白叶枯病菌毒素[2 ] 。本研究从水稻白叶枯病菌培养滤液中提取解毒素蛋
白, 说明水稻白叶枯病菌既能产生毒素, 又可产生解毒素蛋白, 因此, 细菌体内可能同时存在两套酶系
统, 两套系统同时作用于菌体毒素的合成与转化过程, 类似的结果在烟草野火病菌中也曾有报道[4 ] 。
多年来, 国内外学者对病原菌激发子作了不少研究。已从很多病原物或非病原物中提取各种性质不
同的激发子, 如多糖、寡糖、蛋白、糖蛋白等。这些激发子能诱导与寄主抗性有关的PAL 、PO 和几丁
质酶等活性, 激发寄主体内植保素积累和一系列抗病防卫反应, 从而抑制或减轻病害的发生[9 ] 。本实验
结果显示, 从水稻白叶枯病菌培养滤液中提取的解毒蛋白能显著提高水稻叶片PAL 和PO 活性, 并且用
该解毒蛋白处理叶片后再接种致病菌, 感病品种发病明显减轻, 说明水稻白叶枯病菌解毒蛋白除了有解
毒作用外, 可能还有激发子的作用。
本研究分离获得的水稻白叶枯病菌解毒蛋白, 其防病机理可能从两方面起作用: 一方面通过解毒来
减轻病菌对水稻的致病作用; 另一方面又可激发水稻体内抗病相关酶的活性, 调动水稻体内生化抗病防
御系统, 最终起到解毒增抗作用。本研究对水稻白叶枯病菌解毒蛋白进行的精细纯化工作, 有利于今后
解毒蛋白氨基酸序列测定, 进一步克隆解毒基因, 构建高效表达载体, 获取表达产物直接用于病害防
治; 同时, 解毒基因还可通过转基因直接引入植物中, 获得抗性植株。因此, 解毒蛋白的研究在理论和
实践中对水稻白叶枯病的防治将有重要意义。
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