| 黄芩苷是从唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根提取所得的黄酮类物质，具有抗炎抗变态反应、抗微生物、解热、降压利尿、降血脂血糖、利胆解痉等作用［1～2］。黄芩苷是多种中药制剂的有效成分，因此建立黄芩苷的血药浓度测定方法，具有重要意义。本文在文献［34］基础上，进行测定条件优化，采用RPHPLC法，以苯甲酸为内标物测定家兔血浆中黄芩苷的含量，此方法具有简便、专属性强、准确及应用性强等优点，为研究其体内代谢提供方法依据。
1 仪器与药品
LC10A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD10AVP紫外可见分光光度检测器（日本岛津公司）；HW2000色谱工作站。漩涡混合器(天津药典标准仪器厂)；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波清洗器（天津恒奥超声波清洗器）。黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110715-200514），黄芩苷原料药（广州市亿深天然产物科技发展有限公司），内标物苯甲酸为分析纯（天津市大茂化学试剂厂），甲醇、乙腈为色谱纯（天津市四友生物医学技术有限公司），试验用兔子（购于广东省卫生厅实验动物中心）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 以文献［3］中色谱条件为基础改进，色谱柱为DiamonsolTMC18柱（250 mm×4.6 mm,ID,5 μm）；流动相：甲醇水磷酸（体积比55∶45∶0.2）；流速：1 mL/min；检测波长：277 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品25 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得0.5 mg/mL 的黄芩苷对照品储备液。分别精密吸取黄芩苷对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置10 mL容量瓶中，用重蒸水定容，配成5 、25、50、100、150、200、250 μg/mL的系列黄芩苷对照品标准溶液。
2.2.2 血浆样品处理取含有一定量黄芩苷的血浆0.4 mL至5 mL离心管中，加入重蒸水0.4 mL，内标物溶液（0.45 mg/L苯甲酸甲醇溶液）0.4 mL，乙腈0.8 mL，漩涡混合30 s，超声振荡5 min，于3 000 r/min的高速离心机上离心10 min，取上清液经0.45 μm微孔有机滤膜滤过，取续滤液10 μL进样，记录色谱图。
A.空白血浆；B.空白血浆+20 μg/L黄芩苷+90μg/L苯甲酸甲醇溶液；C.血浆样品
a.黄芩苷; b.苯甲酸
图1 样品测定色谱图（略）
Fig.1 Chromatograms of rat plasma samples
2.3 方法的专属性取空白血浆0.4 mL，除不加内标物溶液外，按“2.2.2”项下操作，得色谱图1A，将一定浓度的黄芩苷标准液和内标物溶液加入空白血浆中，依法操作，得色谱图1B，待测物黄芩苷与内标苯甲酸的保留时间分别为9.8 min和11.7 min；取血浆样品，依同法操作，得色谱图1C。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰待测物黄芩苷及内标物的测定。
2.4 标准曲线和线性范围取空白血浆0.4 mL，加入黄芩苷标准系列溶液0.4 mL，配制成相当于黄芩苷血浆质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL，除不加入重蒸水0.4 mL外，按照“2.2.2”项下依法操作。进样10 μL，记录色谱图；以待测物质量浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程：Y= 0085179x-0.00244，r= 0.999 3，表明黄芩苷质量浓度在1~50 μg/mL内呈良好的线性关系，定量下限为0.11 μg/mL。
2.5 精密度与准确度取空白血浆0.4 mL按照“2.4”项下方法制备黄芩苷低、中、高3个浓度（5.0，50.0，250.0 μg/mL）的样品，每一浓度进行3样本分析，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行。以当天的标准曲线计算样品的浓度，求得方法的精密度与回收率，结果见表1。
表1 黄芩苷的准确度和精密度试验结果（略）
Tab.1 Accuracy and precision of the HPLC determination of baicalin
2.6 提取回收率考察取空白血浆0.4 mL，按“2.4”项下的方法制备低、中、高3个浓度（5.00，50.0和250.0 μg/mL）的样品，每个浓度测定3个样品。同时另取空白血浆0.4 mL，除不加重蒸水外，按“2.2.2”项下处理，分取上清液，加入相应浓度的标准溶液0.4 mL，混匀，进样分析，获得相应的峰面积。以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果表明，黄芩苷血浆浓度在5.00，50.0和250.0 μg/mL时的提取回收率分别为61.2％，635％，62.3％，内标溶液经同法提取处理，其提取回收率为64.8％。
2.7 血浆样品的测定 取含有一定量黄芩苷的血浆0.4 mL，按照“22.2”项下进行操作，进行6个样本分析，测得血药浓度为17.96 μg/mL，RSD为2.1%。
3 讨论
3.1 内标物的选择根据文献［3-6］报道，选对硝基苯甲酸作内标物，测定结果与供试品峰重叠；另分别选水杨酸、苯甲酸作内标物，实验结果显示苯甲酸与供试品的分离度在1.5～20，符合要求，且在室温（15～30 ℃）柱效及分离度不受干扰。
3.2 蛋白沉淀剂的选择 分别选用四氢呋喃、乙腈、甲醇作为蛋白沉淀剂及提取溶液，经提取回收率的比较，甲醇的提取率较低，而乙腈和四氢呋喃的效果相当；由于四氢呋喃对色谱测定有干扰，最后选择乙腈作为蛋白沉淀剂及提取液。
3.3 本实验的方法准确，简单、灵敏，能满足生物样品分析的要求，为黄芩苷的血药浓度测定提供依据。
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