| 1 引 言
20 世纪80 年代以来,随着生命科学研究的不断深入,用于多肽及蛋白质分离纯化的色谱方法得到了很大发展。其中,反相液相色谱由于具有许多其它色谱方法不可比拟的优势,正受到人们的关注。它能有效地分离各种多肽混合物,特别适用于分子量不大的蛋白质和多肽物质的分离、纯化和鉴定,在蛋白质及多肽研究中已得到了广泛的应用。
近年来,随着基因组和蛋白质组计划的实施,对不同蛋白质的快速分析、定性以及定量的需求更大,反相液相色谱以其快速简便、灵敏度高、重复性好、分辨率高等优势受到人们的重视,已成为一种常备的不可缺少的分析手段,并用于多肽药物分离中。反相液相色谱与各种质谱技术的结合也已成为蛋白质结构分析的重要手段和发展方向。
2 反相液相色谱
2. 1 简介
反相液相色谱(reverse2phase liquid chromatography , RPLC) 是目前液相色谱分离中使用最为广泛的一种模式,它的特点是固定相的极性比流动相弱。与它相对应的是正相液相色谱或极性相液相色谱(normal phase liquid chromatography) ,如硅胶、氧化铝或离子交换等极性介质为固定相的色谱,其中流动相的极性低于固定相。由于RPLC 固相载体的疏水性,它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用,从而使不同分子在反相柱中彼此分离。疏水性较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱,因此较快流出;反之,疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用,在柱内保留时间相对较长。RPLC 在20 世纪50 年代就已用于许多有机小分子的分离和分析,80 年代后逐步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定,并用于制备规模的分离 。RPLC 与其它色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。由于RPLC 可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)2乙腈(ACN) ,纯化产物不必进行脱盐,因此,可大大简化操作步骤。另外,在其它模式的色谱中,保留时间主要决定于天然蛋白质分子表面的某些基团与固定相配基间的相互作用。而在RPLC 中,蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠,内部某些疏水残基暴露并与固定相相互作用,从而表现出与其它色谱及电泳方法不同的选择性,提供其它方法不能提供的信息,这成为RPLC 在蛋白质及多肽分离分析中的又一个有利因素。由于以上种种原因,RPLC 已成为广泛使用的一种分离模式,普遍用于多肽和蛋白质的分离分析。
2. 2 分离机理
RPLC 分离与流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水相互作用有关。人们对于反相分离中这种疏水作用的本质进行了大量的研究,提出了许多不同理论,但对其机理尚未达成共识,RPLC 中的保留行为究竟是一种吸附过程还是分配过程还存在很多争论 。目前,根据理论分析和实验数据证明,一些研究者认为溶质在RPLC 上的保留是吸附机制和分配机制共同作用的结果 。对于较小分子而言,人们更多考虑其分配机制;而对于多肽和蛋白质这样的生物大分子,由于其分子尺度往往比固定相表面疏水键合相大得多,通常以表面部分区域与固定相发生作用,其保留机制多被认为是主要基于它们在疏水固定相上的吸附。简单地说,在多肽及蛋白质的RPLC 中,初始洗脱条件下洗脱液中有机成分浓度较低,分子与固定相疏水作用较强,几乎完全被固定相吸附。而一旦洗脱液中有机成分达到特定浓度,使得多肽或蛋白质与固定相间作用小于流动相与固定相间的作用时,分子完全从固定相上洗脱下来,几乎不再与固定相发生作用。这一保留机制也被人称为“on2off”机制。正由于多肽和蛋白质这种特殊的保留机制,洗脱液成分极微小的改变就会大大影响多肽和蛋白质的保留行为,从而保证疏水特征相近的多肽或蛋白质得以充分分离[1 ] 。蛋白质及肽段分离中常常采用反相离子对色谱(reversed2phase ion2pair chromatography ,RP2IPC) ,它是通过向流动相中加入两亲离子来提高溶质分子的保留值。阴离子对试剂如三氟乙酸(TFA) 可与多肽的质子化氨基结合,而阳离子对试剂如三乙胺(TEA) 可与多肽的去质子化羧基结合。在RP2IPC 体系中,主要由固定相疏水表面对配对离子的选择性吸附来决定溶质保留值,因此,洗脱液pH 值及配对离子的种类、浓度对样品各成分尤其是疏水性较小的肽段的有效分离非常重要 。
3 反相液相色谱在多肽及蛋白质分离分析中的应用
RPLC 的一个主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和分析。对于分子结构比较简单的多肽和某些蛋白质,在不影响产物的活性或产物在RPLC 后很容易重新折叠复性的前提下,用RPLC 进行纯化制备是一项高效的手段。同时,RPLC 分辨率高和重复性好的特点,使它在蛋白质及多肽分析领域占据核心地位。尽管在RPLC 中有机溶剂的存在及疏水固定相的影响可能导致蛋白质三维结构的改变,但这对分析鉴定并不重要,虽然被分析的蛋白质发生了变性,却能够给出该蛋白质的结构特征及疏水性等信息,并将其精确地与其它蛋白质相区分。
3. 1 多肽及蛋白质纯化
RPLC 可用于绝大多数的多肽纯化。RPLC 流动相以水为基本组成部分,与肽的生物学性质相适应,虽然流动相中的酸、有机溶剂以及固定相均可能使肽的天然构象发生变化,但当这些因素除去后,肽的构象一般能恢复原状,因此在RPLC 中,肽的回收率一般在80 %以上。早在1986 年,人们就用RPLC 对神经肽进行了纯化。Boyes 等也报道了用连续RPLC 对细菌原液中的重组人淀粉状蛋白前体多肽片段进行分离。
与分子量小、空间折叠相对简单的多肽相比,蛋白质的RPLC 分离经常存在一些问题。蛋白质分子量一般都在万级以上,很多有亚基结构,立体构型及构象复杂,与流动相、固定相及样品中的其它成分以及蛋白质本身都可能存在多种复杂的相互作用,会造成谱带扩散、峰形拖尾等问题,甚至发生变性和不可逆吸附,引起回收率和分辨率的降低。因此,随着蛋白质体积和疏水性的增加纯化难度也会增加。但是,选用适当的操作条件,也可用RPLC 对某些蛋白质进行纯化。核糖体蛋白的纯化就是其中一个具有代表性的例子。近年来,关于多肽及蛋白质的RPLC 纯化也取得了许多成功,如Krusa 等用RPLC 对大豆蛋白进行了纯化和定量分析。
3. 2 肽图
阐明蛋白质的结构、功能,对蛋白质进行深入研究都离不开对其一级结构、修饰位点等的了解。在蛋白水解酶(如胰蛋白酶) 或化学试剂(如溴化氰) 作用下,蛋白质可被部分裂解,RPLC 对肽段混和物可进行有效分离。在这一过程中所获得的反相色谱图即称为该蛋白质的“肽图”。肽图法已成为RPLC 在蛋白质及多肽分析中最重要、最广泛的应用,已用于重组蛋白质量控制、疾病诊断等诸多领域.
反相肽图中常采用C18柱,由于酶消化产物含有大量疏水性各不相同的肽段,因此多采用较窄的梯度并延长梯度时间[28 ] 。由于蛋白质酶解产物中肽段分子量通常较小,借助反相肽图进行蛋白质及多肽分析可得到重复性好、分辨力高的结果,已有多种多肽及蛋白质用RPLC 进行了肽图分析。这其中既包括人生长激素、人粒细胞集落刺激因子这样的重要药物蛋白,也包括聚乙二醇- 人生长激素这样的蛋白质修饰产物。肽图分析有利于确定产物的一维结构,并有可能确定修饰位点。
3. 2. 1 蛋白质序列分析 这是肽图分析的重要应用之一。肽图上各峰经氨基酸分析并结合Edman 降解或电喷雾质谱等手段,可得到每一肽段的精确序列。如Moritz 等用RPLC 对单克隆抗体A33 进行了序列测定[31 ] 。随着质谱技术的发展,反相肽图结合串联质谱已成为一种方便、快捷的序列测定方法,用于重组蛋白的测序。如果酶解过程中控制条件使二硫键不被破坏,通过比较二硫键还原前后的肽图即可判断二硫键的位置。Cunsolo 即用上述方法对一种花粉蛋白中某肽段二硫键的位置进行了表征[32 ] 。如与蛋白质数据库相结合进行分析,反相肽图还可对未知蛋白进行鉴定。如Hoffmann 用RPLC 与质谱联用对LIM1215 细胞中分离出的部分胞质蛋白进行了鉴定[33 ] 。
3. 2. 2 分析蛋白质的细微结构差异 天然蛋白质的色谱通常无法反映蛋白质组成上的细微不同,而RPLC 以其高分辨率在揭示蛋白质结构细微差异上有出色的表现,即使一个氨基酸的改变也可通过相应肽段保留时间的变化清楚反映出来。例如,肽段上脱酰胺作用常常引起保留时间的轻微延长,而氧化产物如甲硫氨酸亚砜或半胱磺酸的形成常引起保留时间的显著下降。同样,变异蛋白质的形成也会引起一个或多个肽段保留时间的变化。在血红蛋白的研究中,人们已用RPLC 分析出多种变异体,还有人利用RPLC 肽图与质谱结合成功鉴定了又一种血红蛋白变异体(b2134Val →Ala) [34 ] 。由于RPLC 在识别蛋白质结构差异上的出色表现,已成为重组蛋白表征及药用蛋白质质量控制的一个有力工具,还可为许多疾病诊断提供依据。
3. 2. 3 蛋白质修饰分析 随着人们对蛋白质修饰的研究不断深入,RPLC 不仅被用来分离修饰与未修饰产物,在修饰产物分析上也得到了很好应用。蛋白质修饰包括蛋白质在体内的翻译后修饰如形成N2甲酸基或N2乙酰基衍生物进行N 端封闭;形成氨基化物进行C 端封闭;Ser 、Thr 、Tyr 等含羟基的氨基酸磷酸化, Asn 的N2糖基化及Ser 、Thr 的O2糖基化。还包括人工化学修饰如聚乙二醇、葡聚糖修饰等。借助RPLC 可阐明修饰的位点及其化学本质。
由于糖肽在RPLC 中的保留行为与其糖基化水平密切相关,糖基化程度越高,保留时间越短[35 ] ,因
此可将糖蛋白水解成肽段后进行反相色谱分析,从而得到糖基化水平及所处肽段。Huddleston 等专门讨论了糖基化的定性分析[36 ] 。同样,磷酸化蛋白质中连接磷酸基的数量、位置等也可从RPLC 分析中得出。无论是翻译后修饰还是化学修饰,修饰位点的测定多采用对蛋白质作肽图后经比较确定被修饰的肽段,再结合质谱分析得到精确位点,这方面已做了许多有意义的工作。Ogueta 等[37 ]就利用RPLC 和离子阱质谱对两种蛋白的磷酸化位点进行了分析,得到了很好的结果。这一方法也可用于化学交联蛋白质分析,如交联RNase A 中的交联位点[38 ] 。该分析方法还可用于蛋白质活性位点及结合位点等的鉴定[39 ] 。但在有些蛋白质的大分子修饰位点判断中,修饰上的分子对酶解及肽段分离的影响会对分析造成困难[40 ] 。
3. 3 酶活测定
随着RPLC 在临床及生物医药中广泛地应用,人们开始利用它来检测体内特定酶的活性。酶活性
测定多采取分光光度法,但这种方法需要所测样品达到一定纯度。RPLC 可经特异监控底物及产物浓度直接测量体液和组织中的酶活性,具有特异性强、简便快速的优点。通常将样品加入合适底物,通过加热、加酸或加入特定抑制剂终止反应,用反相液相色谱测定底物或产物浓度的改变并计算出酶活性,也可直接从活体的体液中底物或产物浓度变化来监测酶活性。另外,由于RPLC 可精确测定肽段的磷酸化,也有人将其用于酪氨酸激酶的活性测定[41 ] 。Hartwick 等[42 ]曾通过RPLC 监测腺苷的浓度来确定红血球中腺苷脱氨酶的活性,还借助RPLC 成功地测定了3′2 AMP 合成酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、黄嘌呤氧化酶等的活性[43～45 ] ,表现出RPLC 在这一领域的巨大潜力。
3. 4 检测蛋白质构象改变
RPLC 应用中的另一个重要方面是对多肽和蛋白质的不同构象中间体及其之间相互转变的研究,这方面已有大量工作,如对胰岛素[46 ] 、溶菌酶[47 ] 、重组生长因子和N2甲基重组生长因子[48 ] 及细胞色素C[49 ] 等多种蛋白质及多肽在RPLC 的疏水环境中构象变化的研究。
这些研究的共同特征是蛋白质和多肽的吸附和解吸附与溶剂或配基引起的构象改变有关。蛋白质在RPLC 固定相上的保留行为是基于蛋白质与固定相配基间的非特异性疏水相互作用,这种疏水作用力的强弱与蛋白质的结构尤其与蛋白质疏水基团的暴露程度有着密切的关系。它不仅取决于蛋白质的氨基酸序列,更取决于蛋白质与固定相发生作用时特定的空间构象。不同条件下,由于蛋白质构象变化会导致蛋白质疏水基团发生不同程度的暴露,与固定相配基作用的位点也随之变化,从而在RPLC 中反映出色谱行为的改变。因此,可以利用RPLC 来分析蛋白质分子表面疏水性和空间构象的稳定性[50 ] 。如果蛋白质或多肽的空间构象比较稳定,那么在各种不同的色谱条件下,蛋白质与配基的结合位点不容易改变,保留机制不变。反之,因空间构象的变化,就有可能采用不同的保留机制。这为测定构象中间体转变过程的动力学及热动力学提供了直接手段。
RPLC 在蛋白质构象改变研究中的应用已表现出巨大潜力。Kumar 等使用RPLC 证明了RNase A 经三氯乙酸处理后构象的改变[51 ] 。还有人通过用RPLC 分离变化过程中的各种折叠中间体,动态监测了牛胰岛素在二硫苏糖醇作用下去折叠的过程[52 ] 。另外,Mccrossin 等还通过RPLC 分离和肽图分析相结合检测了盐酸胍存在下猪生长激素的降解情况[53 ] 。随着反相材料和检测手段的发展,RPLC 在蛋白质构象行为研究中的潜力已被越来越多的人们所认识。
3. 5 研究蛋白质折叠和稳定性中的疏水相互作用
Hodges 等认为可用RPLC 研究蛋白质折叠和稳定性中的疏水作用[54 ] 。当前蛋白质化学家面临的最困难的问题之一就是理解蛋白质的折叠和稳定性,即蛋白质的氨基酸序列如何决定它的三维构象、折叠途径及稳定性。其中一个方法就是利用RPLC 作为生物系统的物理化学模型。由于驱动蛋白质折叠和稳定性的主要作用力是疏水相互作用,蛋白质与RPLC 固定相配基间的疏水相互作用可很好地反映天然蛋白质分子中稳定其三级结构的非极性基团间的相互作用。早在1976 年,Horvath 等就预测RPLC 固定相的疏水表面将成为探测疏水环境中蛋白质螺旋结构稳定性的有效探针[55 ] ,Hodges 等也采用一种双链α2螺旋的蛋白质模型系统在RPLC 中进行了蛋白质折叠和稳定性中的疏水相互作用的研究[54 ] 。目前
这方面的工作不多,但相信随着研究的不断深入,RPLC 会逐渐成为蛋白质中疏水作用分析的一个有力手段。
4 展 望
基因工程技术的发展及蛋白质研究的不断深入,必然需要灵敏、快速、准确的分析方法的支持。由于RPLC 较高的分辨率及独特的选择性,作为一种蛋白质及多肽的分离分析手段已越来越得到人们的认可,并用于许多新兴领域如蛋白质组的分析[33 ,56 ,57 ] 。多种联用技术如RPLC 质谱、RPLC 毛细管电泳及RPLC 生物传感器的出现也使得更加快速的在线分析成为可能,实现了对样品各成分分子量、纯度及活性等的实时分析。相信随着对RPLC 分离机理研究的逐步深入、分离体系的不断完善及各种检测手段如质谱技术的快速发展,反相液相色谱必将在蛋白质及多肽研究领域得到更加广泛的应用。
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